| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-13页 |
| 第1章 前言 | 第13-19页 |
| ·降糖活性因子筛选平台的研究进展 | 第13-16页 |
| ·一般筛选模型 | 第13-14页 |
| ·高通量筛选模型 | 第14-15页 |
| ·展望 | 第15-16页 |
| ·以葡萄糖激酶为靶点的降糖药物的研究 | 第16-18页 |
| ·主要研究内容和意义 | 第18-19页 |
| ·主要研究内容如下 | 第18页 |
| ·研究意义 | 第18-19页 |
| 第2章 人胰葡萄糖激酶克隆与表达 | 第19-35页 |
| ·材料、仪器与试剂 | 第19-21页 |
| ·材料 | 第19页 |
| ·主要仪器 | 第19-20页 |
| ·主要试剂 | 第20-21页 |
| ·方法 | 第21-28页 |
| ·引物设计 | 第21页 |
| ·cDNA第一链合成 | 第21-22页 |
| ·人葡萄糖激酶基因PCR扩增 | 第22页 |
| ·PCR产物鉴定 | 第22页 |
| ·表达载体6HisT-pRSET质粒提取(CH_3COONH_4法) | 第22-23页 |
| ·表达载体6HisT-pRSET和PCR产物NdeI-BamHI双酶切 | 第23页 |
| ·酶切产物琼脂糖凝胶割胶回收 | 第23-24页 |
| ·PCR产物与原核表达载体6HisT-pRSET连接 | 第24页 |
| ·大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备 | 第24-25页 |
| ·转化E.coli DH5a感受态细胞 | 第25页 |
| ·阳性克隆的筛选与鉴定 | 第25-26页 |
| ·重组质粒6HisT-pRSET-PGK转化E.coli BL21 | 第26页 |
| ·6HisT-pRSET-PGK融合蛋白的诱导表达 | 第26-27页 |
| ·表达蛋白的SDS-PAGE分析 | 第27-28页 |
| ·结果 | 第28-32页 |
| ·PCR扩增结果 | 第28页 |
| ·6HisT-pRSET-PGK表达载体的构建 | 第28-30页 |
| ·阳性克隆的菌落PCR筛选 | 第30页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第30-31页 |
| ·重组质粒的测序结果 | 第31页 |
| ·重组质粒6HisT-pRSET-PGK在大肠杆菌中诱导表达及可溶性分析 | 第31-32页 |
| ·讨论与结论 | 第32-35页 |
| ·讨论 | 第32-33页 |
| ·结论 | 第33-35页 |
| 第3章 人胰葡萄糖激酶的纯化与酶活分析 | 第35-47页 |
| ·仪器与试剂 | 第35-36页 |
| ·主要仪器 | 第36页 |
| ·主要试剂 | 第36页 |
| ·方法 | 第36-40页 |
| ·PGK纯化条件的确定 | 第36-37页 |
| ·小量蛋白纯化 | 第37页 |
| ·Ni-NTA His.Bind Resin再生 | 第37-38页 |
| ·PGK蛋白纯度分析 | 第38页 |
| ·Bradford法测定蛋白浓度 | 第38页 |
| ·PGK酶活测定 | 第38-39页 |
| ·PGK酶动力学分析 | 第39-40页 |
| ·结果 | 第40-44页 |
| ·PGK纯化条件的确定 | 第40-41页 |
| ·PGK蛋白纯度分析 | 第41页 |
| ·PGK蛋白浓度的测定 | 第41-42页 |
| ·反应体系的波长扫描 | 第42-43页 |
| ·PGK活力测定 | 第43-44页 |
| ·PGK酶动力学分析 | 第44页 |
| ·讨论与结论 | 第44-47页 |
| ·讨论 | 第44-45页 |
| ·结论 | 第45-47页 |
| 第4章 降糖活性因子体外筛选平台的建立 | 第47-63页 |
| ·材料、仪器与试剂 | 第48-49页 |
| ·材料 | 第48-49页 |
| ·主要仪器 | 第49页 |
| ·主要试剂 | 第49页 |
| ·方法 | 第49-53页 |
| ·筛选体系的建立 | 第49-50页 |
| ·Plackett-Burman试验 | 第50-51页 |
| ·Central composite design(CCD)分析法 | 第51-53页 |
| ·预测模型的验证 | 第53页 |
| ·中药各提取组分葡萄糖激酶激活剂的初步筛选 | 第53页 |
| ·结果 | 第53-61页 |
| ·筛选体系的确定 | 第53-56页 |
| ·Plackett-Burma试验结果 | 第56页 |
| ·中心组合设计试验结果 | 第56-60页 |
| ·预测模型的验证 | 第60页 |
| ·中药各提取组分初步筛选结果分析 | 第60-61页 |
| ·讨论与结论 | 第61-63页 |
| ·讨论 | 第61-62页 |
| ·结论 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-67页 |
| 致谢 | 第67-68页 |
| 附录1:重组质粒6HisT-pRSET-PGK目的片段测序结果 | 第68-70页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第70页 |
| 个人简历 | 第70页 |
