| 中文摘要 | 第1-3页 |
| Abstract | 第3-4页 |
| 中文文摘 | 第4-6页 |
| 目录 | 第6-10页 |
| 绪论 | 第10-24页 |
| 第一节 课题研究背景 | 第10-11页 |
| 第二节 酿酒酵母研究背景 | 第11-12页 |
| 第三节 酿酒酵母乙醛脱氢酶的研究状况 | 第12-13页 |
| 1)乙醛脱氢酶Ⅱ(ALD2) | 第13页 |
| 2)乙醛脱氢酶Ⅲ(ALD3) | 第13页 |
| 3)乙醛脱氢酶Ⅳ(ALD4) | 第13页 |
| 4)乙醛脱氢酶Ⅴ(ALD5) | 第13页 |
| 5)乙醛脱氢酶Ⅵ(ALD6) | 第13页 |
| 第四节 酿酒酵母甘油脱氢酶的研究状况 | 第13-17页 |
| 第五节 酿酒酵母育种技术 | 第17-22页 |
| ·诱变育种 | 第17页 |
| ·细胞融合法 | 第17-18页 |
| ·基因工程法 | 第18-22页 |
| ·引入异源基因构建基因工程菌株 | 第18-20页 |
| ·调控酿酒酵母代谢途径 | 第20-22页 |
| ·PCR介导的酿酒酵母基因敲除技术 | 第20页 |
| ·调控酿酒酵母mRNA转录途径 | 第20-22页 |
| ·反义技术调控mRNA转录 | 第21-22页 |
| 第六节 本课题研究内容与目的 | 第22-24页 |
| ·研究目的 | 第22页 |
| ·研究内容 | 第22-24页 |
| 第一章 删除酿酒酵母工程菌ALD4基因 | 第24-48页 |
| 第一节 前言 | 第24页 |
| 第二节 材料方法 | 第24-37页 |
| ·材料 | 第24-26页 |
| ·菌株与质粒 | 第24-25页 |
| ·主要试剂 | 第25页 |
| ·培养基与试剂配制 | 第25-26页 |
| ·主要设备与仪器 | 第26页 |
| ·引物设计 | 第26页 |
| ·方法 | 第26-35页 |
| ·Cre/loxP系统 | 第26-27页 |
| ·酿酒酵母基因组提取 | 第27页 |
| ·质粒DNA制备 | 第27页 |
| ·酵母菌ALD4基因存在验证 | 第27-28页 |
| ·基因删除组件的构建 | 第28-29页 |
| ·基因删除组件的验证 | 第29-32页 |
| ·酿酒酵母ALD4删除组件PCR产物胶回收 | 第29页 |
| ·PCR回收产物的连接与转化 | 第29-31页 |
| ·DH5α感受态细胞的制备 | 第30页 |
| ·CaCl_2法转化DH5α感受态细胞 | 第30-31页 |
| ·阳性克隆的鉴定与质粒提取 | 第31-32页 |
| ·阳性克隆质粒测序 | 第32页 |
| ·ALD4基因的删除 | 第32-33页 |
| ·克隆子验证 | 第33-34页 |
| ·筛选标记的切除和重复利用 | 第34-35页 |
| ·酿酒酵母Y01与DY01生长试验 | 第35页 |
| ·酿酒酵母Y01与DY01发酵性能评估 | 第35-37页 |
| ·酿酒酵母Y01与DY01粗酶液的提取 | 第35-36页 |
| ·酿酒酵母Y01与DY01乙醛脱氢酶酶活测定 | 第36页 |
| ·酿酒酵母Y01与DY01发酵产物乙醇检测 | 第36-37页 |
| 第三节 结果与分析 | 第37-46页 |
| ·酿酒酵母基因组的提取 | 第37页 |
| ·酵母菌基因ALD4验证 | 第37-38页 |
| ·构建ALD4基因删除组件 | 第38-39页 |
| ·删除组件的测序验证 | 第39页 |
| ·删除组件同源重组验证 | 第39-40页 |
| ·KanMX选择标记的切除 | 第40-41页 |
| ·删除ALD4另一条等位基因 | 第41-42页 |
| ·酿酒酵母Y01与DY01生长试验 | 第42-43页 |
| ·酿酒酵母Y01与DY01发酵性能评估 | 第43-46页 |
| ·酿酒酵母Y01与DY01粗酶液的定量 | 第43-44页 |
| ·酿酒酵母Y01与DY01乙醛脱氢酶酶活测定 | 第44-45页 |
| ·酿酒酵母Y01与DY01发酵产物乙醇检测 | 第45-46页 |
| 第四节 小结与讨论 | 第46-48页 |
| 第二章 酿酒酵母INVS1 GPD1基因沉默研究 | 第48-62页 |
| 第一节 前言 | 第48页 |
| 第二节 材料与方法 | 第48-56页 |
| ·材料 | 第48-50页 |
| ·菌株与质粒 | 第48-49页 |
| ·主要试剂 | 第49页 |
| ·主要培养基与试剂配制 | 第49页 |
| ·主要仪器设备 | 第49-50页 |
| ·方法 | 第50-56页 |
| ·反义表达载体插入片段的扩增 | 第50-52页 |
| ·酿酒酵母INVSc1基因组DNA的提取 | 第50页 |
| ·扩增反义组件引物设计 | 第50-51页 |
| ·反义片段的扩增 | 第51-52页 |
| ·重组表达质粒的构建 | 第52-54页 |
| ·重组表达质粒酶切鉴定 | 第54-55页 |
| ·感受态细胞的制备与转化筛选 | 第55页 |
| ·重组菌pYES2.0-GPD1/pYES2.0的诱导表达 | 第55页 |
| ·重组菌pYES2.0-GPD1/pYES2.0GPDH酶活检测 | 第55页 |
| ·重组菌pYES2.0-GPD1/pYES2.0甘油含量检测 | 第55-56页 |
| 第三节 结果与分析 | 第56-59页 |
| ·pYES2.0-GPD1反义表达组件的构建 | 第56-57页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第57-58页 |
| ·酿酒酵母INVSc1-pYES2.0/INVSc1-pYGPD1酶活检测 | 第58-59页 |
| ·酿酒酵母INVSc1-pYES2.0/INVSc1-pYGPD1甘油定量 | 第59页 |
| 第四节 小结与讨论 | 第59-62页 |
| 第三章 酿酒酵母DY01 GPD1基因沉默研究 | 第62-80页 |
| 第一节 前言 | 第62页 |
| 第二节 材料与方法 | 第62-70页 |
| ·材料 | 第62-63页 |
| ·菌株与质粒 | 第62页 |
| ·主要试剂 | 第62页 |
| ·主要培养基与试剂配制 | 第62-63页 |
| ·主要仪器设备 | 第63页 |
| ·方法 | 第63-70页 |
| ·重叠延伸PCR引物的设计 | 第63-66页 |
| ·酿酒酵母DY01基因组DNA的提取 | 第64页 |
| ·反义片段的扩增 | 第64-66页 |
| ·反义组件SGPD1片段扩增 | 第64-65页 |
| ·抗性选择标记KanMX片段扩增 | 第65-66页 |
| ·工程菌GPD1基因5'UTR扩增 | 第66页 |
| ·重组表达质粒的构建 | 第66-68页 |
| ·重组反义表达载体鉴定 | 第68-69页 |
| ·酿酒酵母感受态细胞的制备与转化筛选 | 第69页 |
| ·重组菌DY01 pYES2.0-GPD1/KanMX的诱导表达 | 第69页 |
| ·重组菌DY01 pYES2.0-GPD1/KanMX酶活检测 | 第69页 |
| ·重组菌pYES2.0-GPD1/KanMX甘油含量检测 | 第69页 |
| ·酿酒酵母DY01与DRY01发酵产物乙醇检测 | 第69-70页 |
| 第三节 结果与分析 | 第70-77页 |
| ·pYES2.0-GPD1/KanMX反义表达组件的构建 | 第70-71页 |
| ·酿酒酵母SGPDl基因与KanMX基因的扩增 | 第70页 |
| ·重叠延伸PCR扩增SGPD1/KanMX片段 | 第70-71页 |
| ·反义组件GPD1/KanMX的克隆 | 第71-74页 |
| ·酿酒酵母Y01与DRY01生长曲线测定 | 第74-75页 |
| ·酿酒酵母DY01与DRY01 GPDH酶活检测 | 第75-76页 |
| ·酿酒酵母DY01与DRY01甘油含量检测 | 第76页 |
| ·酿酒酵母DY01与DRY01乙醇含量检测 | 第76-77页 |
| 第四节 小结与讨论 | 第77-80页 |
| 第四章 结论 | 第80-82页 |
| 参考文献 | 第82-88页 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 | 第88-90页 |
| 致谢 | 第90-92页 |
| 个人简历 | 第92-93页 |
