| 摘要 | 第1-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 前言 | 第13-23页 |
| 1 幽门螺杆菌与胃部的相关疾病 | 第13-16页 |
| ·幽门螺杆菌与胃炎 | 第13-14页 |
| ·幽门螺杆菌与消化性溃疡 | 第14页 |
| ·幽门螺杆菌与胃癌和胃MALT淋巴瘤 | 第14-16页 |
| ·幽门螺杆菌与毒力因子 | 第16页 |
| 2 细菌基因突变技术的应用 | 第16页 |
| 3 幽门螺杆菌毒力致病因子研究进展 | 第16-22页 |
| ·CagA | 第17-18页 |
| ·VacA | 第18-19页 |
| ·尿素酶 | 第19页 |
| ·BabA | 第19-20页 |
| ·DupA | 第20页 |
| ·OipA | 第20-21页 |
| ·SabA | 第21页 |
| ·其他黏附因子 | 第21-22页 |
| 4 研究目的与意义 | 第22-23页 |
| 第一部分 实验一 幽门螺杆菌基因敲除方法的建立 | 第23-32页 |
| 1. 材料和方法 | 第23-28页 |
| ·实验材料 | 第23-25页 |
| ·质粒和菌株 | 第23-24页 |
| ·酶与试剂 | 第24页 |
| ·培养基及溶液 | 第24-25页 |
| ·实验方法 | 第25-28页 |
| ·H.pylori的培养 | 第25页 |
| ·H.pylori基因组的制备 | 第25页 |
| ·引物序列设计 | 第25-26页 |
| ·PCR扩增目的基因 | 第26页 |
| ·打靶载体的构建 | 第26-27页 |
| ·幽门螺杆菌高效电转化方法的建立 | 第27页 |
| ·全菌PCR鉴定含重组质粒的转化子 | 第27-28页 |
| 2 结果 | 第28-30页 |
| ·幽门螺杆菌cagA基因的敲除 | 第28-30页 |
| ·用于cagA基因敲除的长同源臂外源DNA的构建 | 第28-29页 |
| ·打靶载体的构建 | 第29页 |
| ·基因的敲除及PCR鉴定 | 第29-30页 |
| 3 讨论 | 第30-32页 |
| 实验二 幽门螺杆菌hp0596基因缺失突变体的构建 | 第32-40页 |
| 1 材料和方法 | 第32-34页 |
| ·实验材料 | 第32页 |
| ·实验方法 | 第32-34页 |
| ·打靶载体的构建 | 第32-33页 |
| ·电转感受态的制备及电击转化 | 第33页 |
| ·全菌PCR鉴定含重组质粒的转化子 | 第33-34页 |
| ·H. pylori26695(Δ0596)基因缺失突变株的RNA水平分析 | 第34页 |
| ·H. pylori 26695Δ0596基因缺失突变株的全菌蛋白和免疫印迹分析 | 第34页 |
| 2 结果 | 第34-38页 |
| ·幽门螺杆菌hp0596基因的敲除 | 第34-37页 |
| ·打靶载体 | 第34-36页 |
| ·hp0596基因的敲除及PCR鉴定 | 第36-37页 |
| ·hp0596基因缺失突变株的RT-PCR分析 | 第37页 |
| ·H. pylori26695Δ0596基因缺失突变株的全菌蛋白分析 | 第37-38页 |
| 3 讨论 | 第38-40页 |
| 第二部分 利用反选择系统在幽门螺杆菌中建立无痕敲除方法 | 第40-52页 |
| 1 材料与方法 | 第40-44页 |
| ·实验材料 | 第40-41页 |
| ·实验方法 | 第41-44页 |
| ·引物合成与测序 | 第41-42页 |
| ·打靶载体的构建 | 第42页 |
| ·全菌PCR鉴定含重组质粒的转化子 | 第42-43页 |
| ·RNA水平的鉴定以及反转录RT-PCR的鉴定 | 第43页 |
| ·H.pylori26695(ΔureB)基因缺失突变株的免疫印迹分析 | 第43页 |
| ·幽门螺杆菌尿素酶活性分析 | 第43-44页 |
| 2 结果 | 第44-50页 |
| ·幽门螺杆菌ureB基因敲除 | 第44-48页 |
| ·PCR扩增体系及其打靶载体的鉴定 | 第44-47页 |
| ·H.pylori26695ΔureB缺失突变株的PCR鉴定 | 第47-48页 |
| ·H.pylori26695(ΔureB)缺失突变株的RT-PCR鉴定 | 第48-49页 |
| ·H.pylori26695 ΔureB缺失突变株的免疫印迹鉴定 | 第49-50页 |
| ·H.pylori26695(ΔureB)缺失突变株的尿素酶活性的分析 | 第50页 |
| 3 讨论 | 第50-52页 |
| 第三部分 S.Typhimurium黏附素lpfA在H.pylori中的表达及其应用研究 | 第52-66页 |
| 1 材料与方法 | 第53-58页 |
| ·实验材料 | 第53-54页 |
| ·质粒和菌株 | 第53页 |
| ·酶与试剂 | 第53-54页 |
| ·培养基 | 第54页 |
| ·溶液 | 第54页 |
| ·实验方法 | 第54-58页 |
| ·幽门螺杆菌感染的动物模型的建立 | 第54-55页 |
| ·引物 | 第55页 |
| ·穿梭载体的改造 | 第55-56页 |
| ·λRed基因的诱导表达和感受态细胞的制备 | 第56页 |
| ·电击转化 | 第56-57页 |
| ·全菌PCR鉴定含重组质粒的转化子 | 第57页 |
| ·氨苄青霉素抗性基因的去除 | 第57页 |
| ·穿梭表达载体的构建 | 第57页 |
| ·外膜蛋白的提取 | 第57-58页 |
| 2 结果 | 第58-64页 |
| ·小鼠胃黏膜定植HPSS1菌株的鉴定 | 第58-59页 |
| ·E.coli-H.pylori穿梭表达载体的构建 | 第59-61页 |
| ·穿梭打靶载体的鉴定 | 第60页 |
| ·用PCR方法鉴定含重组质粒的转化子 | 第60-61页 |
| ·鉴定氨苄青霉素抗性基因的去除 | 第61页 |
| ·穿梭表达载体的鉴定 | 第61-62页 |
| ·黏附素lpfA蛋白表达 | 第62-63页 |
| ·黏附素lpfA蛋白在外膜的表达 | 第63-64页 |
| 3 讨论 | 第64-66页 |
| ·幽门螺杆菌感染的动物模型的建立 | 第64页 |
| ·质粒的选择和构建 | 第64-65页 |
| ·肠黏附素蛋白的选择和表达 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-71页 |
| 致谢 | 第71-72页 |
| 攻读硕士学位期间参加的学术活动与发表文章 | 第72页 |
