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酿酒酵母产D-乳酸的代谢工程研究

摘要第5-7页
Abstract第7-8页
生化名词缩写表第16-17页
第1章 引言第17-46页
    1.1 D-乳酸的生产方法第17-24页
        1.1.1 D-乳酸的性质第17页
        1.1.2 D-乳酸的用途第17-20页
        1.1.3 D-乳酸的生产方法及存在的问题第20-21页
        1.1.4 D-乳酸生产菌株的代谢工程研究进展第21-24页
        1.1.5 酿酒酵母作为细胞工厂的优势第24页
    1.2 外源基因在酿酒酵母中的表达第24-34页
        1.2.1 酿酒酵母分子操作工具第24-28页
        1.2.2 蛋白转录因子调控基因表达第28页
        1.2.3 启动子调控基因表达第28-30页
        1.2.4 终止子调控基因表达第30-32页
        1.2.5 核糖体调控基因表达第32-33页
        1.2.6 酿酒酵母染色体位置效应对基因表达的影响第33-34页
    1.3 酿酒酵母耐酸机制研究进展第34-42页
        1.3.1 有机酸对酿酒酵母的毒性第35-36页
        1.3.2 酿酒酵母胞内pH的调控机制第36页
        1.3.3 基于多药耐药转运蛋白的调控机制第36-37页
        1.3.4 基于细胞壁重构的耐酸机制第37-38页
        1.3.5 基于感应和响应营养和能量限制的耐酸机制第38-39页
        1.3.6 基于酿酒酵母组学的耐酸机制研究第39-42页
    1.4 乙酰辅酶A合成途径的研究进展第42-45页
    1.5 本论文的研究目的及工作设想第45-46页
第2章 调控元件组合优化D-乳酸脱氢酶表达第46-79页
    2.1 前言第46-47页
    2.2 实验材料第47-56页
        2.2.1 实验试剂与仪器第47-50页
        2.2.2 菌株、质粒和引物第50-54页
        2.2.3 培养基和溶液的配置第54-56页
    2.3 实验方法第56-64页
        2.3.1 酿酒酵母基因组的制备第56页
        2.3.2 酿酒酵母感受态的制备与转化第56-57页
        2.3.3 基因敲除组件与质粒的构建第57-61页
        2.3.4 工程菌的发酵条件第61页
        2.3.5 高产D-LA整合菌株的筛选第61-62页
        2.3.6 实时荧光定量PCR和D-LDH酶活检测第62-63页
        2.3.7 高产D-LA菌株的基因组重测序第63-64页
        2.3.8 分析方法第64页
    2.4 实验结果第64-76页
        2.4.1 组合优化表达D-LDH提高酿酒酵母产D-LA第64-67页
        2.4.2 含质粒菌株D-LDH的酶活与mRNA水平分析第67-69页
        2.4.3 整合菌株的筛选第69-74页
        2.4.4 高产D-LA菌株的分批补料发酵第74-76页
    2.5 讨论第76-78页
    2.6 小结第78-79页
第3章 耐酸耐盐相关基因IoGas1在酿酒酵母中的表达第79-103页
    3.1 前言第79-80页
    3.2 实验材料第80-84页
        3.2.1 试剂与仪器第80页
        3.2.2 菌株、质粒和引物第80-83页
        3.2.3 培养基和溶液的配置第83-84页
    3.3 实验方法第84-85页
        3.3.1 酿酒酵母基因组的制备第84页
        3.3.2 酿酒酵母感受态的制备与转化第84页
        3.3.3 基因敲除组件与质粒的构建第84页
        3.3.4 工程菌株的好氧培养第84-85页
        3.3.5 工程菌株的发酵条件第85页
        3.3.6 实时荧光定量PCR检测第85页
        3.3.7 分析方法第85页
    3.4 实验结果第85-99页
        3.4.1 过表达IoGas1基因提高酿酒酵母的耐酸性第85-89页
        3.4.2 酿酒酵母中整合IoGas1基因提高D-LA产量第89-96页
        3.4.3 弱化甘油和乙醇途径对D-LA生产的影响第96-99页
    3.5 讨论第99-101页
    3.6 小结第101-103页
第4章 酿酒酵母中耐乙酸基因的表达优化第103-125页
    4.1 前言第103页
    4.2 实验材料第103-107页
        4.2.1 试剂与仪器第103-104页
        4.2.2 菌株、质粒和引物第104-107页
        4.2.3 培养基和溶液的配置第107页
    4.3 实验方法第107-109页
        4.3.1 酿酒酵母基因组的制备第107页
        4.3.2 酿酒酵母感受态的制备与转化第107-108页
        4.3.3 基因敲除组件与质粒的构建第108页
        4.3.4 工程菌株的好氧培养第108页
        4.3.5 工程菌的发酵条件第108页
        4.3.6 实时荧光定量PCR检测第108-109页
        4.3.7 分析方法第109页
    4.4 实验结果第109-121页
        4.4.1 过表达Whi2, Haa1,Acs2基因对酿酒酵母耐乙酸的影响第109-112页
        4.4.2 敲除Adh1菌株的乙酸浓度比较第112-114页
        4.4.3 过表达Whi2基因对D-LA生产的影响第114-117页
        4.4.4 过表达Acs2基因对D-LA生产的影响第117-120页
        4.4.5 过表达Haa1基因对D-LA生产的影响第120-121页
    4.5 讨论第121-122页
    4.6 小结第122-125页
第5章 大肠杆菌乙酰辅酶A合成基因在酿酒酵母中的表达第125-151页
    5.1 前言第125-126页
    5.2 实验材料第126-129页
        5.2.1 试剂与仪器第126页
        5.2.2 菌株、质粒和引物第126-128页
        5.2.3 培养基和溶液的配置第128-129页
    5.3 实验方法第129-132页
        5.3.1 酿酒酵母基因组的制备第129页
        5.3.2 酿酒酵母感受态的制备与转化第129页
        5.3.3 基因敲除组件与质粒的构建第129-130页
        5.3.4 工程菌株生长速率的测定第130页
        5.3.5 工程菌株的发酵条件第130页
        5.3.6 实时荧光定量PCR检测第130页
        5.3.7 乙酰化乙醛脱氢酶酶活检测第130-131页
        5.3.8 胞内乙醛的测定第131页
        5.3.9 胞内代谢物非靶向分析第131-132页
        5.3.10 分析方法第132页
    5.4 实验结果第132-145页
        5.4.1 表达大肠杆菌的乙酰化乙醛脱氢酶基因mhpF第132-136页
        5.4.2 表达大肠杆菌的乙酰化乙醛脱氢酶基因eutE第136-142页
        5.4.3 同时表达大肠杆菌的乙酰化乙醛脱氢酶基因eutE和mhpF第142-144页
        5.4.4 eutE与mhpF基因的mRNA水平及酶活分析第144-145页
    5.5 讨论第145-150页
    5.6 小结第150-151页
第6章 结论与展望第151-155页
    6.1 主要结论第151-152页
    6.2 创新之处第152页
    6.3 今后的工作建议第152-155页
参考文献第155-167页
附录A Ty1、D-乳酸脱氢酶、启动子和终止子序列第167-171页
附录B IoGas1基因序列和氨基酸序列第171-173页
附录C 乙酰化乙醛脱氢酶(A-ALD)基因序列第173-175页
附录D D-乳酸色谱图及乙醛色谱图/质谱图第175-177页
附录E 高产D-LA菌株的遗传稳定性研究第177-179页
致谢第179-181页
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果第181页

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