| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 生化名词缩写表 | 第16-17页 |
| 第1章 引言 | 第17-46页 |
| 1.1 D-乳酸的生产方法 | 第17-24页 |
| 1.1.1 D-乳酸的性质 | 第17页 |
| 1.1.2 D-乳酸的用途 | 第17-20页 |
| 1.1.3 D-乳酸的生产方法及存在的问题 | 第20-21页 |
| 1.1.4 D-乳酸生产菌株的代谢工程研究进展 | 第21-24页 |
| 1.1.5 酿酒酵母作为细胞工厂的优势 | 第24页 |
| 1.2 外源基因在酿酒酵母中的表达 | 第24-34页 |
| 1.2.1 酿酒酵母分子操作工具 | 第24-28页 |
| 1.2.2 蛋白转录因子调控基因表达 | 第28页 |
| 1.2.3 启动子调控基因表达 | 第28-30页 |
| 1.2.4 终止子调控基因表达 | 第30-32页 |
| 1.2.5 核糖体调控基因表达 | 第32-33页 |
| 1.2.6 酿酒酵母染色体位置效应对基因表达的影响 | 第33-34页 |
| 1.3 酿酒酵母耐酸机制研究进展 | 第34-42页 |
| 1.3.1 有机酸对酿酒酵母的毒性 | 第35-36页 |
| 1.3.2 酿酒酵母胞内pH的调控机制 | 第36页 |
| 1.3.3 基于多药耐药转运蛋白的调控机制 | 第36-37页 |
| 1.3.4 基于细胞壁重构的耐酸机制 | 第37-38页 |
| 1.3.5 基于感应和响应营养和能量限制的耐酸机制 | 第38-39页 |
| 1.3.6 基于酿酒酵母组学的耐酸机制研究 | 第39-42页 |
| 1.4 乙酰辅酶A合成途径的研究进展 | 第42-45页 |
| 1.5 本论文的研究目的及工作设想 | 第45-46页 |
| 第2章 调控元件组合优化D-乳酸脱氢酶表达 | 第46-79页 |
| 2.1 前言 | 第46-47页 |
| 2.2 实验材料 | 第47-56页 |
| 2.2.1 实验试剂与仪器 | 第47-50页 |
| 2.2.2 菌株、质粒和引物 | 第50-54页 |
| 2.2.3 培养基和溶液的配置 | 第54-56页 |
| 2.3 实验方法 | 第56-64页 |
| 2.3.1 酿酒酵母基因组的制备 | 第56页 |
| 2.3.2 酿酒酵母感受态的制备与转化 | 第56-57页 |
| 2.3.3 基因敲除组件与质粒的构建 | 第57-61页 |
| 2.3.4 工程菌的发酵条件 | 第61页 |
| 2.3.5 高产D-LA整合菌株的筛选 | 第61-62页 |
| 2.3.6 实时荧光定量PCR和D-LDH酶活检测 | 第62-63页 |
| 2.3.7 高产D-LA菌株的基因组重测序 | 第63-64页 |
| 2.3.8 分析方法 | 第64页 |
| 2.4 实验结果 | 第64-76页 |
| 2.4.1 组合优化表达D-LDH提高酿酒酵母产D-LA | 第64-67页 |
| 2.4.2 含质粒菌株D-LDH的酶活与mRNA水平分析 | 第67-69页 |
| 2.4.3 整合菌株的筛选 | 第69-74页 |
| 2.4.4 高产D-LA菌株的分批补料发酵 | 第74-76页 |
| 2.5 讨论 | 第76-78页 |
| 2.6 小结 | 第78-79页 |
| 第3章 耐酸耐盐相关基因IoGas1在酿酒酵母中的表达 | 第79-103页 |
| 3.1 前言 | 第79-80页 |
| 3.2 实验材料 | 第80-84页 |
| 3.2.1 试剂与仪器 | 第80页 |
| 3.2.2 菌株、质粒和引物 | 第80-83页 |
| 3.2.3 培养基和溶液的配置 | 第83-84页 |
| 3.3 实验方法 | 第84-85页 |
| 3.3.1 酿酒酵母基因组的制备 | 第84页 |
| 3.3.2 酿酒酵母感受态的制备与转化 | 第84页 |
| 3.3.3 基因敲除组件与质粒的构建 | 第84页 |
| 3.3.4 工程菌株的好氧培养 | 第84-85页 |
| 3.3.5 工程菌株的发酵条件 | 第85页 |
| 3.3.6 实时荧光定量PCR检测 | 第85页 |
| 3.3.7 分析方法 | 第85页 |
| 3.4 实验结果 | 第85-99页 |
| 3.4.1 过表达IoGas1基因提高酿酒酵母的耐酸性 | 第85-89页 |
| 3.4.2 酿酒酵母中整合IoGas1基因提高D-LA产量 | 第89-96页 |
| 3.4.3 弱化甘油和乙醇途径对D-LA生产的影响 | 第96-99页 |
| 3.5 讨论 | 第99-101页 |
| 3.6 小结 | 第101-103页 |
| 第4章 酿酒酵母中耐乙酸基因的表达优化 | 第103-125页 |
| 4.1 前言 | 第103页 |
| 4.2 实验材料 | 第103-107页 |
| 4.2.1 试剂与仪器 | 第103-104页 |
| 4.2.2 菌株、质粒和引物 | 第104-107页 |
| 4.2.3 培养基和溶液的配置 | 第107页 |
| 4.3 实验方法 | 第107-109页 |
| 4.3.1 酿酒酵母基因组的制备 | 第107页 |
| 4.3.2 酿酒酵母感受态的制备与转化 | 第107-108页 |
| 4.3.3 基因敲除组件与质粒的构建 | 第108页 |
| 4.3.4 工程菌株的好氧培养 | 第108页 |
| 4.3.5 工程菌的发酵条件 | 第108页 |
| 4.3.6 实时荧光定量PCR检测 | 第108-109页 |
| 4.3.7 分析方法 | 第109页 |
| 4.4 实验结果 | 第109-121页 |
| 4.4.1 过表达Whi2, Haa1,Acs2基因对酿酒酵母耐乙酸的影响 | 第109-112页 |
| 4.4.2 敲除Adh1菌株的乙酸浓度比较 | 第112-114页 |
| 4.4.3 过表达Whi2基因对D-LA生产的影响 | 第114-117页 |
| 4.4.4 过表达Acs2基因对D-LA生产的影响 | 第117-120页 |
| 4.4.5 过表达Haa1基因对D-LA生产的影响 | 第120-121页 |
| 4.5 讨论 | 第121-122页 |
| 4.6 小结 | 第122-125页 |
| 第5章 大肠杆菌乙酰辅酶A合成基因在酿酒酵母中的表达 | 第125-151页 |
| 5.1 前言 | 第125-126页 |
| 5.2 实验材料 | 第126-129页 |
| 5.2.1 试剂与仪器 | 第126页 |
| 5.2.2 菌株、质粒和引物 | 第126-128页 |
| 5.2.3 培养基和溶液的配置 | 第128-129页 |
| 5.3 实验方法 | 第129-132页 |
| 5.3.1 酿酒酵母基因组的制备 | 第129页 |
| 5.3.2 酿酒酵母感受态的制备与转化 | 第129页 |
| 5.3.3 基因敲除组件与质粒的构建 | 第129-130页 |
| 5.3.4 工程菌株生长速率的测定 | 第130页 |
| 5.3.5 工程菌株的发酵条件 | 第130页 |
| 5.3.6 实时荧光定量PCR检测 | 第130页 |
| 5.3.7 乙酰化乙醛脱氢酶酶活检测 | 第130-131页 |
| 5.3.8 胞内乙醛的测定 | 第131页 |
| 5.3.9 胞内代谢物非靶向分析 | 第131-132页 |
| 5.3.10 分析方法 | 第132页 |
| 5.4 实验结果 | 第132-145页 |
| 5.4.1 表达大肠杆菌的乙酰化乙醛脱氢酶基因mhpF | 第132-136页 |
| 5.4.2 表达大肠杆菌的乙酰化乙醛脱氢酶基因eutE | 第136-142页 |
| 5.4.3 同时表达大肠杆菌的乙酰化乙醛脱氢酶基因eutE和mhpF | 第142-144页 |
| 5.4.4 eutE与mhpF基因的mRNA水平及酶活分析 | 第144-145页 |
| 5.5 讨论 | 第145-150页 |
| 5.6 小结 | 第150-151页 |
| 第6章 结论与展望 | 第151-155页 |
| 6.1 主要结论 | 第151-152页 |
| 6.2 创新之处 | 第152页 |
| 6.3 今后的工作建议 | 第152-155页 |
| 参考文献 | 第155-167页 |
| 附录A Ty1、D-乳酸脱氢酶、启动子和终止子序列 | 第167-171页 |
| 附录B IoGas1基因序列和氨基酸序列 | 第171-173页 |
| 附录C 乙酰化乙醛脱氢酶(A-ALD)基因序列 | 第173-175页 |
| 附录D D-乳酸色谱图及乙醛色谱图/质谱图 | 第175-177页 |
| 附录E 高产D-LA菌株的遗传稳定性研究 | 第177-179页 |
| 致谢 | 第179-181页 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 | 第181页 |
