| 摘要 | 第10-13页 |
| ABSTRACT | 第13-16页 |
| 符号及缩略说明表 | 第17-19页 |
| 绪论 | 第19-20页 |
| 第一章 文献综述 | 第20-40页 |
| 1 镰刀菌的研究进展 | 第20-25页 |
| 1.1 禾谷镰刀菌的研究现状 | 第20-23页 |
| 1.1.1 禾谷镰刀菌分类的研究进展 | 第21-22页 |
| 1.1.2 禾谷镰刀菌毒素的研究进展 | 第22-23页 |
| 1.2 尖孢镰刀菌的研究进展 | 第23-25页 |
| 1.2.1 尖孢镰刀菌的分类 | 第24-25页 |
| 1.2.2 尖孢镰刀菌的侵染过程及防治方法 | 第25页 |
| 2 杀菌剂氰烯菌酯的研究进展 | 第25-29页 |
| 2.1 杀菌剂氰烯菌酯的概况 | 第25-26页 |
| 2.2 杀菌剂氰烯菌酯的作用方式研究现状 | 第26-27页 |
| 2.3 禾谷镰刀菌对氰烯菌酯抗性机制的研究进展 | 第27-29页 |
| 3 镰刀菌基因组学及RNA-seq的研究进展 | 第29-34页 |
| 3.1 镰刀菌基因组学研究进展 | 第29-31页 |
| 3.2 镰刀菌RNA-seq研究进展 | 第31-34页 |
| 参考文献 | 第34-40页 |
| 第二章 禾谷镰刀菌对氰烯菌酯抗药性相关基因FgpsB的功能研究 | 第40-68页 |
| 1 材料与方法 | 第41-51页 |
| 1.1 菌株、质粒、杀菌剂与培养基 | 第41-42页 |
| 1.2 试剂 | 第42页 |
| 1.3 分子生物学技术 | 第42-45页 |
| 1.3.1 禾谷镰刀菌基因组DNA的提取 | 第42页 |
| 1.3.2 禾谷镰刀菌总RNA的提取 | 第42-43页 |
| 1.3.3 常规PCR反应体系及程序 | 第43页 |
| 1.3.4 Double-joint PCR反应体系及程序 | 第43-44页 |
| 1.3.5 反转录PCR(RT-PCR) | 第44页 |
| 1.3.6 荧光定量PCR (qRT-PCR) | 第44-45页 |
| 1.3.7 Southern Blot | 第45页 |
| 1.4 禾谷镰刀菌FgApsB基因的序列及系统进化分析 | 第45页 |
| 1.5 禾谷镰刀菌FgApsB基因敲除及回复载体的构建 | 第45-46页 |
| 1.6 转化子验证 | 第46-48页 |
| 1.6.1 药剂验证 | 第46页 |
| 1.6.2 PCR验证 | 第46页 |
| 1.6.3 cDNA验证 | 第46页 |
| 1.6.4 Southem杂交验证 | 第46-48页 |
| 1.7 FgApsB基因敲除突变体表型分析 | 第48-50页 |
| 1.7.1 对氰烯菌酯敏感性测定 | 第48-49页 |
| 1.7.2 菌丝生长速率及产孢量分析 | 第49页 |
| 1.7.3 对渗透压、细胞壁胁迫、细胞膜胁迫的敏感性测定 | 第49页 |
| 1.7.4 菌丝形态、芽管和分生孢子的显微观察以及细胞核染色的荧光观察 | 第49页 |
| 1.7.5 致病力实验 | 第49-50页 |
| 1.7.6 离体产DON毒素能力测定 | 第50页 |
| 1.8 FgApsB基因敲除突变体对色素合成途径、毒素合成途径以及细胞壁胁迫中关键基因的表达量影响 | 第50-51页 |
| 2 结果与分析 | 第51-61页 |
| 2.1 禾谷镰刀菌FgApsB基因的序列及系统进化分析 | 第51-52页 |
| 2.2 禾谷镰刀菌FgApsB基因敲除突变体和回复突变体的转化子验证 | 第52-54页 |
| 2.3 禾谷镰刀菌FgApsB基因敲除突变体和回复突变体的表型分析 | 第54-61页 |
| 2.3.1 对氰烯菌酯敏感性的测定 | 第54-55页 |
| 2.3.2 菌丝生长速率测定及菌丝形态显微观察 | 第55-56页 |
| 2.3.3 FgApsB基因在色素生物合成过程中的作用 | 第56-57页 |
| 2.3.4 FgApsB基因在无性繁殖和细胞核迁移及定位中的作用 | 第57-58页 |
| 2.3.5 FgApsB基因在细胞壁抗逆反应中的作用 | 第58-59页 |
| 2.3.6 FgApsB基因对致病力的作用 | 第59-60页 |
| 2.3.7 FgApsB基因对DON生物合成及相关基因表达的影响 | 第60-61页 |
| 3 讨论 | 第61-63页 |
| 参考文献 | 第63-68页 |
| 第三章 禾谷镰刀菌丝束蛋白FgFim对氰烯菌酯的抗性调控及功能研究 | 第68-100页 |
| 1 材料与方法 | 第69-78页 |
| 1.1 菌株、质粒、杀菌剂与培养基 | 第69-70页 |
| 1.2 试剂 | 第70页 |
| 1.3 分子生物学技术 | 第70-72页 |
| 1.3.1 Tail-PCR反应体系及程序 | 第70-72页 |
| 1.3.2 Tail-PCR产物纯化,克隆,测序,比对 | 第72页 |
| 1.4 禾谷镰刀菌对氰烯菌酯高抗药性菌株Y2021A的HPH-HSV-tk随机插入突变体库筛选 | 第72页 |
| 1.5 禾谷镰刀菌FgFim基因的鉴定及序列分析 | 第72-73页 |
| 1.6 禾谷镰刀菌FgFim基因敲除载体、回复载体及与Fgβ_2-tub双敲除载体的构建 | 第73-75页 |
| 1.7 转化子验证 | 第75-76页 |
| 1.8 敲除突变体的表型分析 | 第76-77页 |
| 1.8.1 对氰烯菌酯敏感性测定 | 第76页 |
| 1.8.2 菌丝生长速率及产孢量分析 | 第76页 |
| 1.8.3 对渗透压、氧化压、金属离子胁迫、细胞壁胁迫、细胞膜胁迫的敏感性测定 | 第76页 |
| 1.8.4 菌丝形态、分生孢子萌发及芽管伸长的显微观察 | 第76页 |
| 1.8.5 菌丝胞内甘油含量测定 | 第76-77页 |
| 1.8.6 产子囊壳及致病力实验 | 第77页 |
| 1.8.7 禾谷镰刀菌侵染麦粒的产DON毒素能力测定 | 第77页 |
| 1.9 基因表达分析 | 第77-78页 |
| 1.9.1 FgFim敲除对细胞壁完整途径基因FgMkk1、FgSlt2、FgGls2的影响 | 第77-78页 |
| 1.9.2 FgFim敲除对麦角甾醇合成基因Cyp51A,B,C的影响 | 第78页 |
| 1.9.3 FgFim敲除对毒素合成基因Tri5和Tri6的影响 | 第78页 |
| 2 结果与分析 | 第78-91页 |
| 2.1 禾谷镰刀菌氰烯菌酯高抗菌株Y2021A的HPH-HSV-tk的随机插入突变体库的筛选及鉴定 | 第78页 |
| 2.2 禾谷镰刀菌FgFim基因的鉴定及序列分析 | 第78-80页 |
| 2.3 禾谷镰刀菌FgFim基因敲除突变体和回复突变体的转化子验证 | 第80-81页 |
| 2.4 FgFim基因在禾谷镰刀菌的药敏性调控及其他生命活动中的作用 | 第81-91页 |
| 2.4.1 对氰烯菌酯敏感性和抗药性水平的调控 | 第81-83页 |
| 2.4.2 FgFim在禾谷镰刀菌菌丝生长和无性及有性繁殖中的作用 | 第83-86页 |
| 2.4.3 FgFim在禾谷镰刀菌抗逆反应中的作用 | 第86-90页 |
| 2.4.4 FgFim对禾谷镰刀菌致病力的影响 | 第90页 |
| 2.4.5 FgFim在禾谷镰刀菌DON毒素生物合成中的作用 | 第90-91页 |
| 3 讨论 | 第91-94页 |
| 参考文献 | 第94-100页 |
| 第四章 全基因组测序表明myosin5的点突变导致禾谷镰刀菌对氰烯菌酯的抗性 | 第100-130页 |
| 1 材料与方法 | 第101-108页 |
| 1.1 菌株、质粒、杀菌剂与培养基 | 第101-103页 |
| 1.2 试剂 | 第103页 |
| 1.3 分子生物学技术 | 第103页 |
| 1.4 基因组重测序 | 第103-104页 |
| 1.4.1 测序方法 | 第103页 |
| 1.4.2 数据分析 | 第103-104页 |
| 1.5 22个功能注释基因的克隆和测序 | 第104页 |
| 1.6 Myosin-5的序列和结构域分析 | 第104页 |
| 1.7 Myosin-5基因置换载体的构建 | 第104-107页 |
| 1.8 转化子验证 | 第107页 |
| 1.9 替代突变体的表型分析 | 第107页 |
| 1.9.1 对氰烯菌酯敏感性测定 | 第107页 |
| 1.9.2 菌丝生长速率分析及菌落形态观察 | 第107页 |
| 1.10 表达量分析 | 第107页 |
| 1.11 禾谷镰刀菌myosin-5马达结构域的同源建模 | 第107-108页 |
| 2 结果与分析 | 第108-124页 |
| 2.1 全基因组重测序的质量 | 第108-113页 |
| 2.2 禾谷镰刀菌氰烯菌酯抗性菌株myosin-5点突变的鉴定 | 第113-115页 |
| 2.3 禾谷镰刀菌氰烯菌酯敏感和抗性菌株myosin-5基因置换及药敏性验证 | 第115-119页 |
| 2.4 Myosiin-5序列及结构域与药敏性的关系分析 | 第119-121页 |
| 2.5 Myosin-5抗药性突变体菌落表型及菌丝生长速率 | 第121页 |
| 2.6 禾谷镰刀菌myosin-5,myosin-2B和typeⅡ myosin表达量与药敏性分析 | 第121页 |
| 2.7 禾谷镰刀菌myosin-5马达结构域同源建模及与氰烯菌酯分子对接的分值 | 第121-124页 |
| 3 讨论 | 第124-126页 |
| 参考文献 | 第126-130页 |
| 第五章 尖孢镰刀菌Myosin-5点突变对氰烯菌酯的抗药性研究 | 第130-148页 |
| 1 材料与方法 | 第131-136页 |
| 1.1 菌株、质粒、杀菌剂与培养基 | 第131-132页 |
| 1.2 试剂 | 第132页 |
| 1.3 分子生物学技术 | 第132-133页 |
| 1.3.1 尖孢镰刀菌基因组DNA的提取 | 第132页 |
| 1.3.2 常规PCR反应体系及程序 | 第132页 |
| 1.3.3 Overlapping PCR反应体系及程序 | 第132-133页 |
| 1.4 孢子和菌丝形态的显微观察 | 第133页 |
| 1.5 氰烯菌酯敏感性测定 | 第133页 |
| 1.6 同源的myosin5马达结构域的序列比对 | 第133页 |
| 1.7 FoMyo5置换突变体的构建 | 第133-135页 |
| 1.8 FoMyo5置换突变体的马达结构域测序验证 | 第135-136页 |
| 2 结果与分析 | 第136-142页 |
| 2.1 禾谷镰刀菌、亚洲镰刀菌和六个不同来源的尖孢镰刀菌菌株对氰烯菌酯的敏感性 | 第136-138页 |
| 2.2 氰烯菌酯对尖孢镰刀菌无性繁殖的影响 | 第138-139页 |
| 2.3 FoMyo5与FgMyo5马达结构域的同源性及与氰烯菌酯药敏性的相关性 | 第139-141页 |
| 2.4 敏感菌株Fo32931和抗性菌株Fo47,Fol4287中FoMyo5的基因置换及对氰烯菌酯的敏感性 | 第141-142页 |
| 3 讨论 | 第142-144页 |
| 参考文献 | 第144-148页 |
| 第六章 RNA-seq分析亚洲镰刀菌对氰烯菌酯药理作用的响应调控机制研究 | 第148-178页 |
| 1 材料与方法 | 第149-157页 |
| 1.1 菌株、杀菌剂与培养基 | 第149-150页 |
| 1.2 氰烯菌酯敏感和抗性突变体的构建 | 第150页 |
| 1.3 对氰烯菌酯敏感性测定 | 第150页 |
| 1.4 总RNA提取 | 第150页 |
| 1.5 总RNA样品检测 | 第150页 |
| 1.6 RNA-seq测序 | 第150-152页 |
| 1.6.1 文库构建 | 第151-152页 |
| 1.6.2 文库检测 | 第152页 |
| 1.6.3 上机测序 | 第152页 |
| 1.7 RNA-seq分析 | 第152-157页 |
| 1.7.1 原始序列数据 | 第152页 |
| 1.7.2 测序数据质量评估 | 第152页 |
| 1.7.3 参考序列比对分析 | 第152-153页 |
| 1.7.4 可变剪切分析 | 第153-154页 |
| 1.7.5 新转录本预测 | 第154页 |
| 1.7.6 SNP和InDel分析 | 第154-155页 |
| 1.7.7 基因表达水平分析 | 第155页 |
| 1.7.8 RNA-Seq相关性检查 | 第155页 |
| 1.7.9 差异表达分析 | 第155-156页 |
| 1.7.10 差异基因GO富集分析 | 第156页 |
| 1.7.11 差异基因KEGG富集分析 | 第156-157页 |
| 2 结果与分析 | 第157-171页 |
| 2.1 氰烯菌酯敏感和抗性突变体的构建 | 第157-158页 |
| 2.2 亚洲镰刀菌对氰烯菌酯敏感和抗性突变体的RNA-seq差异 | 第158-159页 |
| 2.3 氰烯菌酯敏感和抗性突变体的基因表达差异(DEGs分析) | 第159-161页 |
| 2.4 DEG的基因簇聚类分析和功能富集 | 第161-162页 |
| 2.5 DEG的GO的类别 | 第162-163页 |
| 2.6 DEG的KEGG途径分析 | 第163-164页 |
| 2.7 与细胞周期和DNA复制及ABC转运蛋白相关的代谢途径 | 第164-168页 |
| 2.8 可变剪切分析 | 第168-171页 |
| 3 讨论 | 第171-173页 |
| 参考文献 | 第173-178页 |
| 结论 | 第178-182页 |
| 一、本文获得的主要结果 | 第178-180页 |
| 二、本文的主要创新点 | 第180页 |
| 三、本文尚待解决的问题 | 第180-182页 |
| 附录 | 第182-192页 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 | 第192-194页 |
| 致谢 | 第194页 |
