| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 英文缩写说明 | 第13-15页 |
| 1 绪论 | 第15-27页 |
| 1.1 人血清白蛋白 | 第15-20页 |
| 1.1.1 人血清白蛋白的结构与体内合成 | 第15-16页 |
| 1.1.2 人血清白蛋白的生理功能与临床应用 | 第16页 |
| 1.1.3 人血清白蛋白的研究现状 | 第16-20页 |
| 1.2 毕赤酵母表达系统 | 第20-25页 |
| 1.2.1 毕赤酵母表达系统简介 | 第20页 |
| 1.2.2 毕赤酵母表达系统的主要优势及劣势 | 第20-22页 |
| 1.2.3 提高外源蛋白在毕赤酵母表达系统中表达量的相关策略 | 第22-25页 |
| 1.3 立题依据和研究内容 | 第25-27页 |
| 2 人血清白蛋白表达菌株的构建与筛选 | 第27-59页 |
| 2.1 试验材料 | 第27-33页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第27页 |
| 2.1.2 试验试剂、溶液与培养基 | 第27-32页 |
| 2.1.3 试验仪器与设备 | 第32-33页 |
| 2.2 试验方法 | 第33-44页 |
| 2.2.1 人血清白蛋白基因的PCR扩增及回收 | 第33-35页 |
| 2.2.2 PCR回收产物与载体的酶切、回收及连接 | 第35-36页 |
| 2.2.3 连接产物的转化、重组阳性转化子的抗性筛选及质粒抽提 | 第36-38页 |
| 2.2.4 重组质粒pPIC9K-hsa的菌液PCR、酶切验证及测序验证 | 第38-39页 |
| 2.2.5 电转质粒和感受态毕赤酵母菌株的制备 | 第39-40页 |
| 2.2.6 表达质粒的电击转化 | 第40-41页 |
| 2.2.7 MD平板转化子的筛选及表达 | 第41页 |
| 2.2.8 MD平板转化子的G418抗性筛选及表达 | 第41-42页 |
| 2.2.9 菌体OD600测量 | 第42页 |
| 2.2.10 聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第42-43页 |
| 2.2.11 目的蛋白浓度检测 | 第43-44页 |
| 2.2.12 蛋白免疫印迹 | 第44页 |
| 2.3 试验结果 | 第44-56页 |
| 2.3.1 人血清白蛋白基因的PCR扩增及回收 | 第44-46页 |
| 2.3.2 PCR回收产物与pPIC9K载体的酶切、回收及连接 | 第46页 |
| 2.3.3 连接产物的转化、重组阳性转化子的抗性筛选及质粒抽提 | 第46-47页 |
| 2.3.4 重组质粒pPIC9K-hsa的菌液PCR、质粒酶切及测序验证 | 第47-49页 |
| 2.3.5 电转质粒和感受态毕赤酵母菌株的制备 | 第49-50页 |
| 2.3.6 表达质粒的电击转化 | 第50页 |
| 2.3.7 MD平板转化子的筛选及表达 | 第50-52页 |
| 2.3.8 MD平板转化子的G418抗性筛选及表达 | 第52-55页 |
| 2.3.9 蛋白免疫印迹 | 第55-56页 |
| 2.4 讨论 | 第56-58页 |
| 2.5 本章小结 | 第58-59页 |
| 3 人血清白蛋白摇瓶水平的表达条件优化 | 第59-94页 |
| 3.1 试验材料 | 第59-61页 |
| 3.1.1 菌株与质粒 | 第59页 |
| 3.1.2 试验试剂、溶液与培养基 | 第59-60页 |
| 3.1.3 试验仪器与设备 | 第60-61页 |
| 3.2 试验方法 | 第61-66页 |
| 3.2.1 基本诱导条件的优化 | 第61-62页 |
| 3.2.2 培养诱导期碳源和氮源的优化 | 第62-63页 |
| 3.2.3 诱导期添加辅助表达物的优化 | 第63-65页 |
| 3.2.4 生长及诱导培养基的优化 | 第65-66页 |
| 3.3 试验结果 | 第66-90页 |
| 3.3.1 基本诱导条件的优化 | 第66-71页 |
| 3.3.2 培养诱导期碳源和氮源的优化 | 第71-78页 |
| 3.3.3 诱导期添加辅助表达物的优化 | 第78-85页 |
| 3.3.4 生长及诱导培养基的优化 | 第85-90页 |
| 3.4 讨论 | 第90-92页 |
| 3.5 本章小结 | 第92-94页 |
| 4 罐上高密度发酵和产物的分离纯化及鉴定 | 第94-125页 |
| 4.1 试验材料 | 第94-97页 |
| 4.1.1 菌株与质粒 | 第94页 |
| 4.1.2 试验试剂、溶液与培养基 | 第94-96页 |
| 4.1.3 试验仪器与设备 | 第96-97页 |
| 4.2 试验方法 | 第97-104页 |
| 4.2.1 种子液制备 | 第97-98页 |
| 4.2.2 发酵罐的装配、灭菌及电极标定 | 第98-99页 |
| 4.2.3 分批发酵阶段 | 第99页 |
| 4.2.4 补料分批发酵阶段 | 第99-100页 |
| 4.2.5 诱导发酵阶段 | 第100-101页 |
| 4.2.6 发酵上清液的初步处理 | 第101页 |
| 4.2.7 Blue Sepharose亲和层析 | 第101-102页 |
| 4.2.8 Phenyl Sepharose疏水层析 | 第102-103页 |
| 4.2.9 纯化产物的纯度鉴定及总回收率计算 | 第103页 |
| 4.2.10 纯化产物的N端测序及质谱鉴定 | 第103-104页 |
| 4.3 试验结果 | 第104-121页 |
| 4.3.1 种子液制备 | 第104页 |
| 4.3.2 分批发酵阶段 | 第104页 |
| 4.3.3 补料分批发酵阶段 | 第104-105页 |
| 4.3.4 诱导发酵阶段 | 第105-112页 |
| 4.3.5 Blue Sepharose亲和层析 | 第112-114页 |
| 4.3.6 Phenyl Sepharose疏水层析 | 第114-115页 |
| 4.3.7 纯化产物的纯度检测及总回收率计算 | 第115-120页 |
| 4.3.8 纯化产物的N端测序及质谱鉴定 | 第120-121页 |
| 4.4 讨论 | 第121-123页 |
| 4.5 本章小结 | 第123-125页 |
| 全文总结 | 第125-127页 |
| 参考文献 | 第127-133页 |
| 创新性分析 | 第133-134页 |
| 对进一步研究工作的设想和建议 | 第134-136页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文、专利申请 | 第136-137页 |
| 致谢 | 第137-138页 |
