| 中文摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 简写词表 | 第7-14页 |
| 第一章 ENTV综述 | 第14-24页 |
| 1、ENTV的概述 | 第14页 |
| 2、ENTV病原学 | 第14-17页 |
| 2.1 病毒形态结构 | 第14-15页 |
| 2.2 致病机理 | 第15页 |
| 2.3 临床症状 | 第15-16页 |
| 2.4 病理组织学研究 | 第16页 |
| 2.5 培养特性 | 第16页 |
| 2.6 ENTV理化性质研究 | 第16-17页 |
| 3 基因组结构和功能 | 第17-20页 |
| 3.1 LTR基因 | 第17页 |
| 3.2 gag基因 | 第17-18页 |
| 3.3 pro基因 | 第18页 |
| 3.4 Pol基因 | 第18页 |
| 3.5 env基因 | 第18-20页 |
| 3.5.1 表面蛋白(SU) | 第19页 |
| 3.5.2 穿膜蛋白(TM) | 第19-20页 |
| 4 ENTV鼻内肿瘤病毒的分布和流行 | 第20-21页 |
| 4.1 ENTV鼻内肿瘤病毒的分布 | 第20页 |
| 4.2 ENTV羊鼻内肿瘤病毒的流行因素 | 第20-21页 |
| 4.2.1 病毒因素 | 第20页 |
| 4.2.2 环境因素 | 第20-21页 |
| 4.2.3 宿主因素 | 第21页 |
| 5 ENTV羊鼻内肿瘤病毒的诊断方法研究进展 | 第21-22页 |
| 5.1 临床诊断 | 第21页 |
| 5.2 病理诊断 | 第21-22页 |
| 5.3 ENTV羊鼻内肿瘤病毒实验室检测技术 | 第22页 |
| 5.3.1 RT-PCR技术 | 第22页 |
| 5.3.2 ELISA | 第22页 |
| 6 防治措施 | 第22-23页 |
| 6.1 加强饲养管理 | 第22-23页 |
| 6.2 抗原检测 | 第23页 |
| 7 展望 | 第23-24页 |
| 第二章 ENTV RT-PCR检测方法的建立与应用 | 第24-35页 |
| 1 材料 | 第24-25页 |
| 1.1 ENTV阳性病料及菌株 | 第24页 |
| 1.2 主要试剂和耗材 | 第24页 |
| 1.3 溶液配制 | 第24-25页 |
| 1.4 主要仪器及分析软件 | 第25页 |
| 2 方法 | 第25-30页 |
| 2.1 引物的设计与合成 | 第25页 |
| 2.2 ENTV病毒核酸的抽提 | 第25-26页 |
| 2.3 ENTV RT-PCR方法的建立 | 第26-30页 |
| 2.3.1 目的基因的扩增 | 第26-27页 |
| 2.3.1.1 病毒核酸的反转录 | 第26页 |
| 2.3.1.2 目的基因的扩增 | 第26-27页 |
| 2.3.2 目的基因的TA克隆和鉴定 | 第27-29页 |
| 2.3.2.1 RT-PCR产物目的基因片段的回收纯化 | 第27页 |
| 2.3.2.2 病毒基因cDNA与T载体连接 | 第27页 |
| 2.3.2.3 感受态细胞的制备 | 第27-28页 |
| 2.3.2.4 细胞克隆转化 | 第28页 |
| 2.3.2.5 重组克隆菌的筛选培养 | 第28页 |
| 2.3.2.6 重组质粒的提取 | 第28-29页 |
| 2.3.2.7 TA克隆质粒的PCR法鉴定 | 第29页 |
| 2.3.2.8 TA克隆质粒测序鉴定 | 第29页 |
| 2.3.3 特异性试验 | 第29-30页 |
| 2.3.4 敏感性试验 | 第30页 |
| 2.3.5 重复性试验 | 第30页 |
| 2.3.6 收集样品的检测 | 第30页 |
| 3 结果 | 第30-33页 |
| 3.1 目的基因的扩增 | 第30页 |
| 3.2 目的基因的TA克隆和鉴定 | 第30-31页 |
| 3.3 RT-PCR的特异性试验 | 第31-32页 |
| 3.4 RT-PCR的敏感性试验 | 第32页 |
| 3.5 RT-PCR的重复性试验 | 第32页 |
| 3.6 收集样品的检测 | 第32-33页 |
| 4 讨论 | 第33-35页 |
| 第三章 ENTV SU蛋白的原核表达 | 第35-56页 |
| 1 材料 | 第35-37页 |
| 1.1 ENTV病毒核酸及菌株 | 第35页 |
| 1.2 主要试剂 | 第35-36页 |
| 1.3 主要仪器 | 第36页 |
| 1.4 溶液配制 | 第36-37页 |
| 2 方法 | 第37-44页 |
| 2.1 引物的设计 | 第37页 |
| 2.2 病毒RNA的提取 | 第37页 |
| 2.3 SU基因的扩增及鉴定 | 第37-38页 |
| 2.3.1 病毒核酸的反转录 | 第37页 |
| 2.3.2 目的基因的PCR | 第37页 |
| 2.3.3 SU基因的TA克隆 | 第37页 |
| 2.3.4 TA克隆质粒的PCR鉴定 | 第37-38页 |
| 2.3.5 TA克隆质粒测序鉴定 | 第38页 |
| 2.4 SU基因的生物信息学分析 | 第38-39页 |
| 2.4.1 核苷酸多序列分析 | 第38页 |
| 2.4.2 稀有密码子分析 | 第38页 |
| 2.4.3 CpG岛分析 | 第38页 |
| 2.4.4 ENTV-SU基因氨基酸序列分析 | 第38页 |
| 2.4.5 二级结构分析 | 第38页 |
| 2.4.6 亲疏水性分析 | 第38页 |
| 2.4.7 信号肽分析 | 第38-39页 |
| 2.4.8 跨膜区分析 | 第39页 |
| 2.5 pET-SU原核表达载体的制备及鉴定 | 第39-41页 |
| 2.5.1 目的片段的制备 | 第39页 |
| 2.5.2 pET-32a(+)的制备 | 第39-40页 |
| 2.5.3 pET-SU的构建 | 第40页 |
| 2.5.4 pET-SU转化DH5α及鉴定 | 第40-41页 |
| 2.5.5 pET-SU转化E.coli Rosetta(DE3)及鉴定 | 第41页 |
| 2.6 重组表达菌的诱导表达 | 第41-42页 |
| 2.6.1 IPTG浓度的优化 | 第41页 |
| 2.6.2 诱导时间的优化 | 第41页 |
| 2.6.3 融合表达蛋白的SDS-PAGE电泳检测 | 第41-42页 |
| 2.7 重组表达蛋白的可溶性检测 | 第42页 |
| 2.8 重组蛋白的纯化及Western Blot分析 | 第42-44页 |
| 2.8.1 重组蛋白制备 | 第42-43页 |
| 2.8.2 ENTV重组SU蛋白的纯化 | 第43页 |
| 2.8.3 蛋白含量的测定 | 第43页 |
| 2.8.4 抗ENTV病毒血清的制备 | 第43-44页 |
| 2.8.5 重组表达蛋白的Western blot鉴定 | 第44页 |
| 3 结果 | 第44-55页 |
| 3.1 SU基因的扩增 | 第44-45页 |
| 3.2 病毒基因的TA克隆和鉴定 | 第45-46页 |
| 3.3 SU基因的生物信息学分析 | 第46-51页 |
| 3.3.1 ENTV-SU基因测序结果 | 第46-47页 |
| 3.3.2 核苷酸序列同源性及进化树分析 | 第47-48页 |
| 3.3.3 稀有密码子分析 | 第48-49页 |
| 3.3.4 CpG岛分析 | 第49页 |
| 3.3.5 ENTV-SU基因氨基酸序列分析 | 第49页 |
| 3.3.6 二级结构分析 | 第49-50页 |
| 3.3.7 亲疏水性分析 | 第50页 |
| 3.3.8 信号肽分析 | 第50-51页 |
| 3.3.9 跨膜区分析 | 第51页 |
| 3.4 rossta pET32a-SU的原核表达的构建和鉴定 | 第51-52页 |
| 3.5 IPTG诱导浓度的优化 | 第52-53页 |
| 3.6 诱导时间的优化 | 第53-54页 |
| 3.7 pET-SU蛋白的可溶性检测 | 第54页 |
| 3.8 抗ENTV病毒血清的制备 | 第54页 |
| 3.9 重组蛋白SU的纯化以及Western Blot分析 | 第54-55页 |
| 4 讨论 | 第55-56页 |
| 第四章 ENTV间接ELISA检测方法的建立 | 第56-67页 |
| 1 实验材料 | 第56-57页 |
| 1.1 质粒构建 | 第56页 |
| 1.2 血清 | 第56页 |
| 1.3 试剂 | 第56页 |
| 1.4 配制溶液 | 第56-57页 |
| 1.5 仪器 | 第57页 |
| 2 试验方法 | 第57-60页 |
| 2.1 SU蛋白的表达纯化 | 第57页 |
| 2.1.1 SU蛋白收集 | 第57页 |
| 2.1.2 ENTV重组SU蛋白的纯化 | 第57页 |
| 2.2 蛋白含量的测定 | 第57-58页 |
| 2.3 ENTV-SU-ELISA的初步建立 | 第58-59页 |
| 2.3.1 抗原抗体最适稀释度测定 | 第58页 |
| 2.3.2 血清最适反应时间的测定 | 第58页 |
| 2.3.3 封闭最适液浓度测定 | 第58-59页 |
| 2.3.4 最适底物反应时间的测定 | 第59页 |
| 2.3.5 酶标二抗作用时间和浓度测定 | 第59页 |
| 2.3.6 血清阴阳性的判定 | 第59页 |
| 2.4 重复性试验 | 第59-60页 |
| 2.4.1 批间重复 | 第59页 |
| 2.4.2 批内重复 | 第59-60页 |
| 2.5 阻断试验 | 第60页 |
| 2.6 收集样品的检测 | 第60页 |
| 3 结果与分析 | 第60-65页 |
| 3.1 抗原和抗体最佳稀释浓度的确定 | 第60-61页 |
| 3.2 血清最适结合时间的确定 | 第61页 |
| 3.3 最适封闭液的确定 | 第61-62页 |
| 3.4 底物反应时间的确定 | 第62页 |
| 3.5 酶标二抗最佳作用条件的确定 | 第62-63页 |
| 3.6 血清阴阳性判定 | 第63页 |
| 3.7 重复性试验 | 第63-64页 |
| 3.7.1 批间重复 | 第63页 |
| 3.7.2 批内重复 | 第63-64页 |
| 3.8 阻断试验 | 第64页 |
| 3.9 收集样品的检测 | 第64-65页 |
| 4 讨论 | 第65-67页 |
| 参考文献 | 第67-72页 |
| 致谢 | 第72页 |
