| 摘要 | 第4-7页 |
| Abstract | 第7-10页 |
| 主要英文缩写索引 | 第16-17页 |
| 第1章 绪论 | 第17-21页 |
| 第2章 实验材料 | 第21-25页 |
| 2.1 主要实验仪器 | 第21页 |
| 2.2 菌株、细胞株和实验动物 | 第21-22页 |
| 2.3 主要试剂 | 第22-25页 |
| 2.3.1 主要试剂盒 | 第22页 |
| 2.3.2 重要实验试剂 | 第22页 |
| 2.3.3 其他试剂及耗材 | 第22-23页 |
| 2.3.4 培养基及主要溶液配置 | 第23-25页 |
| 第3章 实验方法 | 第25-41页 |
| 3.1 pET30a-MOMP原核表达载体的构建及鉴定 | 第25-30页 |
| 3.1.1 Hela细胞培养 | 第25页 |
| 3.1.2 Cps的繁殖培养 | 第25页 |
| 3.1.3 Cps-DNA模板的提取 | 第25-26页 |
| 3.1.4 MOMP特异性引物的设计 | 第26页 |
| 3.1.5 MOMP基因的PCR扩增 | 第26-27页 |
| 3.1.6 PCR扩增产物的纯化 | 第27页 |
| 3.1.7 pET30a空质粒的提取 | 第27-28页 |
| 3.1.8 PCR扩增产物及pET30a空质粒的双酶切 | 第28页 |
| 3.1.9 纯化回收双酶切产物 | 第28页 |
| 3.1.10 PCR产物与pET30a空质粒酶切后的连接 | 第28页 |
| 3.1.11 制备感受态细菌 | 第28-29页 |
| 3.1.12 重组质粒的转化 | 第29页 |
| 3.1.13 原核表达载体的筛选与鉴定 | 第29-30页 |
| 3.2 pET30a-MOMP原核重组蛋白的表达 | 第30-31页 |
| 3.3 pcDNA3.1(+)-MOMP和pcDNA3.1(+)-MIP真核载体的构建及鉴定 | 第31-34页 |
| 3.3.1 MOMP和MIP基因的PCR扩增 | 第31-32页 |
| 3.3.2 PCR扩增产物的纯化 | 第32页 |
| 3.3.3 pcDNA3.1(+)空质粒的提取 | 第32页 |
| 3.3.4 PCR扩增产物的纯化及pcDNA3.1(+)空质粒的双酶切 | 第32-33页 |
| 3.3.5 纯化回收双酶切产物 | 第33页 |
| 3.3.6 PCR产物与pcDNA3.1(+)空质粒酶切后的连接 | 第33页 |
| 3.3.7 制备感受态细菌 | 第33页 |
| 3.3.8 MOMP和MIP真核重组质粒的转化 | 第33页 |
| 3.3.9 真核重组质粒的筛选与鉴定 | 第33页 |
| 3.3.10 pcDNA3.1(+)-MOMP和pcDNA3.1(+)-MIP真核重组质粒的提取 | 第33-34页 |
| 3.4 化学裂解法菌影(BG)的制备 | 第34-35页 |
| 3.5 pcDNA3.1(+)-MOMP和pcDNA3.1(+)-MIP重组核酸菌影载体的装载构建和鉴定 | 第35-36页 |
| 3.5.1 鼠源性巨噬细胞RAW264.7细胞的培养 | 第35页 |
| 3.5.2 pcDNA3.1(+)-MOMP和pcDNA3.1(+)-MIP重组核酸菌影载体的WesternBlot鉴定 | 第35-36页 |
| 3.6 BALB/c小鼠分组及免疫接种 | 第36-37页 |
| 3.7 免疫活性的鉴定 | 第37-38页 |
| 3.7.1 血清特异性IgG抗体滴度检测 | 第37页 |
| 3.7.2 小鼠脾淋巴细胞增殖情况的检测 | 第37-38页 |
| 3.7.3 小鼠脾淋巴细胞培养液上清中IFN-γ和IL-17A浓度测定 | 第38页 |
| 3.8 抗感染实验 | 第38-40页 |
| 3.8.1 小鼠呼吸道感染Cps | 第38页 |
| 3.8.2 小鼠肺组织病理检测 | 第38-40页 |
| 3.8.3 肺组织匀浆中Cps检测 | 第40页 |
| 3.8.4 肺组织匀浆中IFN-γ和IL-17A浓度测定 | 第40页 |
| 3.9 统计学处理 | 第40-41页 |
| 第4章 实验结果 | 第41-57页 |
| 4.1 pET30a-MOMP原核表达克隆载体的构建及重组蛋白的诱导表达 | 第41-43页 |
| 4.1.1 pET30a-MOMP原核表达克隆载体的构建 | 第41-42页 |
| 4.1.2 pET30a-MOMP原核表达克隆载体的诱导表达 | 第42-43页 |
| 4.2 pcDNA3.1(+)-MOMP和pcDNA3.1(+)-MIP真核重组质粒的构建 | 第43-45页 |
| 4.3 菌影的制备与鉴定 | 第45-46页 |
| 4.4 pcDNA3.1(+)-MOMP和pcDNA3.1(+)-MIP真核重组核酸菌影载体的WesternBlot鉴定 | 第46-47页 |
| 4.5 MOMP和MIP重组核酸菌影疫苗的免疫活性测定 | 第47-50页 |
| 4.5.1 血清特异性IgG抗体水平的测定 | 第47-48页 |
| 4.5.2 CCK-8法检测小鼠脾细胞增殖情况 | 第48-49页 |
| 4.5.3 MOMP、MIP蛋白诱导免疫小鼠脾淋巴细胞上清中IFN-γ和IL-17A的产生水平 | 第49-50页 |
| 4.6 抗感染实验 | 第50-57页 |
| 4.6.1 重组核酸菌影疫苗对Cps感染所引起肺组织病变程度的影响 | 第50-52页 |
| 4.6.2 重组核酸菌影疫苗对肺组织中Cps的影响 | 第52-53页 |
| 4.6.3 重组核酸菌影疫苗对肺组织匀浆中IFN-γ和IL-17A产生水平的影响 | 第53-57页 |
| 第5章 讨论 | 第57-61页 |
| 参考文献 | 第61-71页 |
| 文献综述 | 第71-81页 |
| 参考文献 | 第76-81页 |
| 附录一 | 第81-91页 |
| 附录二 | 第91-95页 |
| 作者攻读学位期间的科研成果 | 第95-97页 |
| 致谢 | 第97页 |
