| 摘要 | 第8-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 缩略语表 | 第14-16页 |
| 第一章 前言 | 第16-32页 |
| 1 microRNAs概述 | 第16-18页 |
| 2 miRNAs的研究方法概述 | 第18-20页 |
| 2.1 生物信息学 | 第18页 |
| 2.2 实验生物学 | 第18-20页 |
| 3 miR-200的研究进展 | 第20-21页 |
| 3.1 miR-200家族基因 | 第20页 |
| 3.2 miR-200家族的功能研究进展 | 第20-21页 |
| 4 实验动物斑马鱼的研究优势 | 第21-23页 |
| 5 斑马鱼的性腺 | 第23-28页 |
| 5.1 性腺的形成 | 第23页 |
| 5.2 斑马鱼的精巢 | 第23-26页 |
| 5.2.1 精巢组织学结构 | 第23-24页 |
| 5.2.2 精子发育 | 第24页 |
| 5.2.3 精子运动能力 | 第24-26页 |
| 5.3 斑马鱼的卵巢组织 | 第26-28页 |
| 5.3.1 卵巢结构 | 第26-27页 |
| 5.3.2 卵母细胞的成熟和排卵 | 第27-28页 |
| 6 基因编辑技术 | 第28-30页 |
| 7 研究目的和意义 | 第30-32页 |
| 第二章 材料与方法 | 第32-57页 |
| 1 实验材料 | 第32-36页 |
| 1.1 实验动物和细胞 | 第32页 |
| 1.2 实验载体、菌株和抗体 | 第32页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第32-34页 |
| 1.4 实验试剂 | 第34-36页 |
| 1.4.1 试剂盒 | 第34页 |
| 1.4.2 常用试剂,酶 | 第34-36页 |
| 2 实验方法 | 第36-57页 |
| 2.1 RNA抽提 | 第36-37页 |
| 2.2 RNA逆转录 | 第37-38页 |
| 2.2.1 通用引物法 | 第37页 |
| 2.2.2 Stem-loop法 | 第37-38页 |
| 2.3 荧光定量PCR | 第38-40页 |
| 2.4 DNA纯化回收 | 第40-41页 |
| 2.4.1 条带单一的产物纯化 | 第40页 |
| 2.4.2 条带不单一的产物纯化 | 第40-41页 |
| 2.5 质粒构建 | 第41-43页 |
| 2.5.1 miRNA靶基因验证质粒构建 | 第41页 |
| 2.5.2 靶位点突变质粒构建 | 第41-42页 |
| 2.5.3 启动子质粒构建 | 第42-43页 |
| 2.6 细胞实验 | 第43-45页 |
| 2.6.1 细胞传代培养 | 第43页 |
| 2.6.2 细胞冻存保藏 | 第43-44页 |
| 2.6.3 冻存细胞的复苏 | 第44页 |
| 2.6.4 细胞转染及荧光素酶活性分析 | 第44-45页 |
| 2.7 显微注射 | 第45页 |
| 2.7.1 制备显微注射胚胎盛放板 | 第45页 |
| 2.7.2 显微注射针的制备 | 第45页 |
| 2.7.3 斑马鱼繁殖以及受精卵收集 | 第45页 |
| 2.8 DNA的提取 | 第45-46页 |
| 2.9 突变体的构建 | 第46-49页 |
| 2.9.1 靶位点的设计 | 第46-47页 |
| 2.9.2 制备Cas9mRNA和gRNAmRNA | 第47-49页 |
| 2.9.3 敲除突变体的检测 | 第49页 |
| 2.10 腹腔注射及激素浸泡 | 第49-50页 |
| 2.10.1 miRNA稳定类似物agomiR在斑马鱼中的腹腔注射 | 第49-50页 |
| 2.10.2 雌激素浸泡实验 | 第50页 |
| 2.11 计算机辅助精液分析(Computer-AidedSpermAnalysiss,CASA) | 第50-53页 |
| 2.11.1 计算机辅助定量分析法 | 第50-51页 |
| 2.11.2 精子运动能力评价指标 | 第51-53页 |
| 2.11.3 精液的采集 | 第53页 |
| 2.12 组织切片苏木精-伊红(HE)染色 | 第53-54页 |
| 2.13 Westernblot | 第54-55页 |
| 2.13.1 总蛋白提取 | 第54页 |
| 2.13.2 Westernblot分析 | 第54-55页 |
| 2.14 产卵与可育性生殖鉴定策略 | 第55页 |
| 2.15 卵细胞的体外成熟诱导 | 第55页 |
| 2.16 卵巢中DHP及LH激素含量的测定 | 第55-56页 |
| 2.17 数据分析 | 第56-57页 |
| 第三章 实验结果 | 第57-84页 |
| 1 miR-200在斑马鱼雄鱼性腺中的功能研究 | 第57-70页 |
| 1.1 miR-200家族成员在成鱼HPG轴上的表达模式 | 第57-58页 |
| 1.2 miR-200家族成员突变体的构建 | 第58-61页 |
| 1.3 23号染色体上的miR-200敲除突变体雄鱼的精子运动能力上升 | 第61-63页 |
| 1.4 amh、wt1a和srd5a2b是miR-200的靶基因 | 第63-65页 |
| 1.5 miR-200b、200a和429a的过表达降低斑马鱼的精子运动能力 | 第65-67页 |
| 1.6 雌激素的处理降低了野生型斑马鱼的精子运动能力,同时miR-429a的表达量上升 | 第67页 |
| 1.7 雌激素的处理并不能降低p53突变的斑马鱼精子运动能力 | 第67-70页 |
| 2 miR-200在斑马鱼雌鱼性腺中的功能研究 | 第70-84页 |
| 2.1 23号miR-200敲除系突变体雌鱼不能正常繁殖 | 第70-71页 |
| 2.2 23号miR-200敲除系突变体雌鱼中miR-200表达量下调显著 | 第71页 |
| 2.3 23号miR-200敲除系突变体不能正常排卵 | 第71-75页 |
| 2.4 23号miR-200敲除系突变体的挽救 | 第75-77页 |
| 2.5 促黄体激素LH在23号miR-200敲除系突变体中下调 | 第77-79页 |
| 2.6 miR-200通过wt1a来抑制促黄体激素LH的表达 | 第79-80页 |
| 2.7 DHP能够部分挽救突变体的排卵 | 第80-82页 |
| 2.8 前列腺素不参与miR-200调控LH的成熟及排卵过程 | 第82-84页 |
| 第四章 讨论 | 第84-91页 |
| 1 斑马鱼23号染色体上的miR-200s影响雄鱼精子运动能力 | 第84-87页 |
| 2 斑马鱼23号染色体上的miR-200s影响雌鱼排卵 | 第87-91页 |
| 参考文献 | 第91-107页 |
| 附录 | 第107-109页 |
| 致谢 | 第109-111页 |
