| 摘要 | 第6-7页 |
| abstract | 第7-8页 |
| 英文缩略表 | 第12-14页 |
| 第一章 引言 | 第14-24页 |
| 1.1 蓝舌病概述 | 第14-15页 |
| 1.2 蓝舌病毒 | 第15-20页 |
| 1.2.1 蓝舌病毒的形态和结构 | 第15-17页 |
| 1.2.2 蓝舌病毒复制周期 | 第17-18页 |
| 1.2.3 BTV与先天免疫应答 | 第18-20页 |
| 1.3 Viperin概述 | 第20-23页 |
| 1.3.1 Viperin的表达调控 | 第20-21页 |
| 1.3.2 Viperin的结构与功能 | 第21-22页 |
| 1.3.2.1 Viperin的抗病毒作用 | 第21-22页 |
| 1.3.2.2 病毒利用Viperin逃逸免疫应答 | 第22页 |
| 1.3.3 Viperin的其它生物学功能 | 第22-23页 |
| 1.4 研究目的与意义 | 第23-24页 |
| 第二章 牛、羊Viperin基因的克隆及序列分析 | 第24-41页 |
| 2.1 材料 | 第24-25页 |
| 2.1.1 细胞、病毒、实验动物、菌株与载体 | 第24页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第24页 |
| 2.1.3 主要仪器设备 | 第24-25页 |
| 2.1.4 溶液及其配制 | 第25页 |
| 2.2 方法 | 第25-32页 |
| 2.2.1 PST细胞的制备 | 第25页 |
| 2.2.2 细胞复苏与培养 | 第25-26页 |
| 2.2.3 传代培养 | 第26页 |
| 2.2.4 实时定量PCR检测BTV感染前后Viperin mRNA含量的变化 | 第26-28页 |
| 2.2.4.1 BTV感染PST、MDBK细胞样品的收集 | 第26页 |
| 2.2.4.2 BTV感染绵羊后血液样品收集 | 第26页 |
| 2.2.4.3 细胞总RNA提取 | 第26-27页 |
| 2.2.4.4 qRT-PCR检测BTV含量 | 第27页 |
| 2.2.4.5 qPCR检测Viperin转录水平的变化 | 第27-28页 |
| 2.2.5 Viperin基因的克隆 | 第28-31页 |
| 2.2.5.1 Viperin基因引物设计与合成 | 第28页 |
| 2.2.5.2 RT-PCR扩增 | 第28页 |
| 2.2.5.3 RT-PCR产物的回收与纯化 | 第28-29页 |
| 2.2.5.4 RT-PCR产物与pMD18-T Vector的连接反应 | 第29页 |
| 2.2.5.5 连接产物的转化与培养 | 第29-30页 |
| 2.2.5.6 重组质粒的箘液PCR鉴定 | 第30页 |
| 2.2.5.7 重组质粒的小量提取 | 第30-31页 |
| 2.2.5.8 重组质粒鉴定 | 第31页 |
| 2.2.6 牛、羊Viperin基因序列分析 | 第31-32页 |
| 2.3 结果与分析 | 第32-39页 |
| 2.3.1 BTV感染后Viperin表达量的变化 | 第32-33页 |
| 2.3.1.1 BTV感染PST、MDBK细胞后Viperin表达检测 | 第32页 |
| 2.3.1.2 BTV感染绵羊后Viperin表达检测 | 第32-33页 |
| 2.3.2 Viperin基因扩增 | 第33页 |
| 2.3.3 Viperin基因克隆 | 第33-34页 |
| 2.3.4 Viperin基因生物信息学分析 | 第34-39页 |
| 2.3.4.1 理化性质 | 第34页 |
| 2.3.4.2 二级结构分析 | 第34-36页 |
| 2.3.4.3 序列比对及进化关系分析 | 第36-38页 |
| 2.3.4.4 三级结构的预测 | 第38-39页 |
| 2.4 讨论 | 第39-41页 |
| 第三章 BTV-16VP5?41 aa蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备 | 第41-49页 |
| 3.1 材料 | 第41-42页 |
| 3.1.1 实验动物 | 第41页 |
| 3.1.2 细胞、重组表达质粒pET-VP5?41aa | 第41页 |
| 3.1.3 试剂 | 第41页 |
| 3.1.4 仪器 | 第41-42页 |
| 3.1.5 试剂配制 | 第42页 |
| 3.2 方法 | 第42-44页 |
| 3.2.1 重组菌pET-VP5?41aa的诱导表达 | 第42-43页 |
| 3.2.2 表达产物的Western blot检测 | 第43页 |
| 3.2.3 重组蛋白的纯化 | 第43页 |
| 3.2.4 多克隆抗体的制备 | 第43-44页 |
| 3.2.5 Western blot鉴定 | 第44页 |
| 3.2.6 细胞免疫荧光 | 第44页 |
| 3.3 结果与分析 | 第44-48页 |
| 3.3.1 重组VP5?41aa蛋白的表达 | 第44-45页 |
| 3.3.2 重组VP5?41aa蛋白的纯化 | 第45-47页 |
| 3.3.3 多克隆抗体的Western blot鉴定 | 第47页 |
| 3.3.4 细胞免疫荧光鉴定 | 第47-48页 |
| 3.4 讨论 | 第48-49页 |
| 第四章 牛、羊Viperin基因的真核表达及其蛋白对BTV复制的影响 | 第49-62页 |
| 4.1 材料 | 第49页 |
| 4.1.1 细胞、病毒、抗体与载体 | 第49页 |
| 4.1.2 试剂 | 第49页 |
| 4.1.3 仪器 | 第49页 |
| 4.2 方法 | 第49-55页 |
| 4.2.1 细胞培养 | 第49-50页 |
| 4.2.2 牛、羊Viperin基因真核表达载体的构建 | 第50-51页 |
| 4.2.3 质粒的大量制备 | 第51-52页 |
| 4.2.4 质粒转染及接毒 | 第52页 |
| 4.2.4.1 转染实验 | 第52页 |
| 4.2.4.2 细胞接毒 | 第52页 |
| 4.2.5 检测目的蛋白的表达 | 第52-53页 |
| 4.2.6 Viperin对BTV增殖的影响 | 第53页 |
| 4.2.7 相对定量PCR分析 | 第53-54页 |
| 4.2.7.1 样品制备与样品总RNA提取 | 第53页 |
| 4.2.7.2 SYBR GreenⅠ实时定量PCR | 第53-54页 |
| 4.2.8 Westernblot分析 | 第54-55页 |
| 4.2.9 蚀斑分析 | 第55页 |
| 4.3 结果 | 第55-60页 |
| 4.3.1 Viperin表达质粒的构建 | 第55-56页 |
| 4.3.2 牛、羊Viperin重组蛋白的表达鉴定 | 第56-57页 |
| 4.3.3 qPCR检测牛、羊Viperin对BTV复制的影响 | 第57页 |
| 4.3.4 Western blot检测牛、羊Viperin对BTV复制的影响 | 第57-60页 |
| 4.3.5 蚀斑分析Viperin过表达后BTV滴度变化 | 第60页 |
| 4.4 讨论 | 第60-62页 |
| 第五章 全文结论 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-68页 |
| 致谢 | 第68-69页 |
| 作者简历 | 第69页 |
