| 中文摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-32页 |
| 1 植物小RNA的研究进展 | 第12-22页 |
| 1.1 miRNA的研究进展 | 第12-19页 |
| 1.1.1 miRNA的发现及概念 | 第12-13页 |
| 1.1.2 miRNA的产生机制 | 第13页 |
| 1.1.3 miRNA基因的起源与进化 | 第13-15页 |
| 1.1.4 miRNA的生理功能 | 第15-19页 |
| 1.2 siRNA的研究进展 | 第19-22页 |
| 1.2.1 ta-siRNA | 第19-21页 |
| 1.2.2 nat-siRNA | 第21-22页 |
| 1.2.3 hc-siRNA | 第22页 |
| 2 小RNA产生和作用途径关键蛋白的研究进展 | 第22-28页 |
| 2.1 植物DCL的研究进展 | 第22-25页 |
| 2.1.1 DCL的种类和结构 | 第22-23页 |
| 2.1.2 DCL的功能 | 第23-25页 |
| 2.2 植物AGO的研究进展 | 第25-26页 |
| 2.2.1 AGO的种类与结构 | 第25页 |
| 2.2.2 AGO的功能 | 第25-26页 |
| 2.3 植物RDR的研究进展 | 第26-28页 |
| 2.3.1 RDR的种类与结构 | 第26-27页 |
| 2.3.2 RDR的功能 | 第27-28页 |
| 3 丹参的研究进展 | 第28-31页 |
| 3.1 丹参的主要化学成分和药理作用 | 第28-29页 |
| 3.2 丹参有效成分代谢途径的研究进展 | 第29-31页 |
| 4 本研究的目的和意义 | 第31-32页 |
| 第二章 丹参幼根小RNA的鉴定 | 第32-54页 |
| 1 实验材料 | 第32页 |
| 2 实验方法 | 第32-33页 |
| 2.1 丹参幼根不同发育时期的总RNA的提取 | 第32页 |
| 2.2 DNase I消化总RNA | 第32-33页 |
| 2.3 丹参小RNA文库制备 | 第33页 |
| 2.4 降解组文库的建立 | 第33页 |
| 3 结果 | 第33-52页 |
| 3.1 RNA提取及检测 | 第34页 |
| 3.2 小RNA测序结果的初步分析 | 第34-35页 |
| 3.3 丹参幼根小RNA的碱基偏好性 | 第35-36页 |
| 3.4 丹参幼根miRNA的确定 | 第36-46页 |
| 3.4.1 丹参幼根保守miRNA的确定 | 第36-38页 |
| 3.4.2 丹参幼根保守miRNA靶基因的预测与靶基因降解组验证 | 第38-46页 |
| 3.5 丹参幼根新miRNA的确定 | 第46-48页 |
| 3.6 丹参幼根phased siRNA的确定 | 第48-50页 |
| 3.7 丹参幼根差异表达的miRNA | 第50-52页 |
| 4 讨论 | 第52-54页 |
| 第三章 丹参小RNA通路关键酶基因家族的克隆与分析 | 第54-92页 |
| 1 实验材料 | 第54-60页 |
| 1.1 植物材料 | 第54页 |
| 1.2 植物材料的胁迫处理 | 第54页 |
| 1.3 菌株与载体 | 第54页 |
| 1.4 酶与各种生化试剂 | 第54页 |
| 1.5 实验所用引物的设计与合成 | 第54-60页 |
| 2 实验方法 | 第60-67页 |
| 2.1 丹参DCL、AGO和RDR基因的预测 | 第60页 |
| 2.2 植物总RNA的提取 | 第60-61页 |
| 2.3 mRNA的分离纯化 | 第61页 |
| 2.4 5'cDNA库的制备 | 第61-63页 |
| 2.4.1 RNA去磷酸化 | 第61页 |
| 2.4.2 沉淀RNA | 第61-62页 |
| 2.4.3 RNA去帽子结构 | 第62页 |
| 2.4.4 去帽的mRNA加接头 | 第62页 |
| 2.4.5 反转录mRNA | 第62-63页 |
| 2.5 3'cDNA库的制备 | 第63页 |
| 2.6 丹参DCL、AGO和RDR基因的克隆 | 第63-65页 |
| 2.6.1 5'RACE和3'RACE实验 | 第63-64页 |
| 2.6.2 PCR产物琼脂糖凝胶回收 | 第64页 |
| 2.6.3 连接、转化与测序 | 第64-65页 |
| 2.6.4 丹参DCL、AGO和RDR基因中间片段的克隆 | 第65页 |
| 2.7 实时荧光定量PCR | 第65-66页 |
| 2.8 生物信息学分析及进化树构建 | 第66页 |
| 2.9 丹参DCL、AGO和RDR基因家族成员与植物miRNA的比对 | 第66页 |
| 2.10 5'RACE验证丹参miRNA切割位点 | 第66-67页 |
| 3 结果与分析 | 第67-87页 |
| 3.1 丹参DCL基因家族的鉴定与分析 | 第67-74页 |
| 3.1.1 丹参DCL基因因1家族的鉴定与克隆 | 第67页 |
| 3.1.2 丹参DCL基因家族的生物信息学分析 | 第67-69页 |
| 3.1.3 丹参DCL基因家族的系统进化树分析 | 第69-71页 |
| 3.1.4 丹参DCL基因家族的组织特异性表达分析 | 第71页 |
| 3.1.5 丹参DCL基因家族成员转录后受miRNA调控分析 | 第71-74页 |
| 3.2 丹参AGO基因家族的鉴定与分析 | 第74-81页 |
| 3.2.1 丹参AGO基因家族的鉴定与克隆 | 第74页 |
| 3.2.2 丹参AGO基因家族的生物信息学分析 | 第74-79页 |
| 3.2.3 丹参AGO基因家族的系统进化树分析 | 第79-80页 |
| 3.2.4 丹参AGO基因家族的组织特异性表达分析 | 第80页 |
| 3.2.5 丹参AGO基因家族成员转录后受miRNA调控分析 | 第80-81页 |
| 3.3 丹参RDR基因家族的鉴定与分析 | 第81-87页 |
| 3.3.1 丹参RDR基因家族的鉴定 | 第81页 |
| 3.3.2 丹参RDR基因家族的生物信息学分析 | 第81-83页 |
| 3.3.3 丹参RDR基因家族的系统进化树分析 | 第83-84页 |
| 3.3.4 丹参RDR基因家族的组织特异性表达分析 | 第84页 |
| 3.3.5 丹参RDR基因家族对胁迫的响应 | 第84-87页 |
| 4 讨论 | 第87-92页 |
| 4.1 丹参DCL基因家族 | 第87-88页 |
| 4.1.1 丹参DCL基因的鉴定 | 第87页 |
| 4.1.2 植物miR162靶位点的演化 | 第87页 |
| 4.1.3 miR162的进化 | 第87-88页 |
| 4.2 丹参AGO基因家族 | 第88-89页 |
| 4.2.1 丹参AGO基因家族的鉴定 | 第88页 |
| 4.2.2 拟南芥和丹参AGO的保守性和多样性 | 第88-89页 |
| 4.2.3 丹参AGO基因的转录后调控 | 第89页 |
| 4.3 丹参RDR基因家族 | 第89-92页 |
| 4.3.1 丹参RDR基因家族的鉴定 | 第89-90页 |
| 4.3.2 丹参RDR基因家族的功能 | 第90-92页 |
| 第四章 RNAi载体构建及遗传转化体系的建立 | 第92-102页 |
| 1 实验材料 | 第92页 |
| 1.1 菌株与载体 | 第92页 |
| 1.2 酶与各种生化试剂 | 第92页 |
| 2 实验方法 | 第92-96页 |
| 2.1 克隆丹参DCL1和DCL2的正反向片段 | 第92页 |
| 2.2 RNAi载体构建详细步骤 | 第92-93页 |
| 2.3 PBI121质粒的提取 | 第93页 |
| 2.4 酶切反应 | 第93-94页 |
| 2.5 切胶回收 | 第94页 |
| 2.6 连接反应体系 | 第94页 |
| 2.7 转化大肠杆菌感受态细胞,PCR验证,酶切验证 | 第94页 |
| 2.8 农杆菌转化感受态细胞的制备 | 第94-95页 |
| 2.9 农杆菌转化方法 | 第95页 |
| 2.10 丹参遗传转化体系的建立 | 第95-96页 |
| 3 结果与分析 | 第96-101页 |
| 3.1 RNAi载体构建 | 第96-100页 |
| 3.1.1 DCL1和DCL2基因的正反向片段的克隆 | 第96页 |
| 3.1.2 插入DCL1和¨DCL2基因的正向片段到PUC19GUS | 第96-97页 |
| 3.1.3 插入DCL1和DCL2基因的反向片段到PUC19GUS | 第97-98页 |
| 3.1.4 PUCDCL1与 PUCDCL2的酶切与PB1121的连接 | 第98页 |
| 3.1.5 PBIDCL1和 PBIDCL2的酶切验证 | 第98页 |
| 3.1.6 pGPTV-HPTDCL1和pGPTV-HPTDCL2的构建 | 第98-99页 |
| 3.1.7 pGPTV-HPTDCL1和pGPTV-HPTDCL2转化农杆菌的PCR验证 | 第99-100页 |
| 3.2 遗传转化体系的建立 | 第100-101页 |
| 4 讨论 | 第101-102页 |
| 4.1 RNAi载体构建 | 第101页 |
| 4.2 遗传转化的影响因素 | 第101-102页 |
| 4.2.1 抗生素对转化的影响 | 第101页 |
| 4.2.2 农杆菌对转化的影响 | 第101页 |
| 4.2.3 外植体的生长时期对转化的影响 | 第101-102页 |
| 第五章 结论与展望 | 第102-104页 |
| 参考文献 | 第104-124页 |
| 致谢 | 第124-125页 |
| 作者简介 | 第125页 |
