| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第一章 引言和文献综述 | 第11-27页 |
| 1.1 锌指核糖核酸酶技术概述 | 第11-15页 |
| 1.1.1 原理 | 第11-12页 |
| 1.1.2 锌指结构域 | 第12-13页 |
| 1.1.3 锌指核酸酶的设计 | 第13-14页 |
| 1.1.4 锌指核酸酶技术在实际中的应用 | 第14-15页 |
| 1.2 OPEN技术 | 第15-17页 |
| 1.3 真核生物中的基因转录调控 | 第17-22页 |
| 1.3.1 起始与调控 | 第18页 |
| 1.3.2 顺式作用元件 | 第18-19页 |
| 1.3.3 反式作用因子及其结构域 | 第19-22页 |
| 1.4 荧光报告系统在哺乳动物细胞中应用 | 第22-23页 |
| 1.5 POP家族在心脏发育中作用 | 第23-25页 |
| 1.6 本文研究的意义 | 第25-27页 |
| 第二章 斑马鱼POP3 OPEN法基因打靶 | 第27-67页 |
| 2.1 前言 | 第27页 |
| 2.2 实验材料 | 第27-31页 |
| 2.2.1 生物信息学软件 | 第27页 |
| 2.2.2 菌种和质粒 | 第27-29页 |
| 2.2.3 主要试剂及仪器 | 第29-31页 |
| 2.3 方法 | 第31-52页 |
| 2.3.1 引物设计与合成 | 第31-32页 |
| 2.3.2 DNA片段PAGE纯化方法 | 第32页 |
| 2.3.3 倍比稀释方法 | 第32页 |
| 2.3.4 化学感受态细胞的制备 | 第32-33页 |
| 2.3.5 电转化学感受态制备 | 第33-34页 |
| 2.3.6 电转化 | 第34-35页 |
| 2.3.7 高感染率辅助噬菌体M13K07制备 | 第35页 |
| 2.3.8 浓度梯度平板的制备方法 | 第35-36页 |
| 2.3.9 β-半乳糖苷酶分析B2H报告菌株实验方法 | 第36-37页 |
| 2.3.10 ZFNs打靶位点选择 | 第37页 |
| 2.3.11 构建B2H(大肠杆菌双杂交)筛选菌株 | 第37-41页 |
| 2.3.12 锌指文库构建 | 第41-45页 |
| 2.3.13 制备三指蛋白噬菌体文库 | 第45-46页 |
| 2.3.14 OPEN法筛选ZFPs | 第46-49页 |
| 2.3.15 构建B2H报告菌株 | 第49-51页 |
| 2.3.16 用B2H检测OPEN法筛选所获三指序列的特异结合能力 | 第51-52页 |
| 2.4 结果与分析 | 第52-67页 |
| 2.4.1 斑马鱼基因POP3的打靶位点分析结果 | 第52页 |
| 2.4.2 B2H(大肠杆菌双杂交)筛选菌株构建结果 | 第52-55页 |
| 2.4.3 锌指库构建 | 第55-58页 |
| 2.4.4 利用OPEN法筛选锌指蛋白编码序列 | 第58-63页 |
| 2.4.5 B2H报告菌株构建 | 第63-64页 |
| 2.4.6 B2H分析ZFP靶位点结合活性 | 第64-66页 |
| 2.4.7 构建ZFP-Fokl融合表达质粒 | 第66-67页 |
| 第三章 斑马鱼POP3相互作用基因的荧光报告分析 | 第67-82页 |
| 3.1 前言 | 第67页 |
| 3.2 实验材料 | 第67-70页 |
| 3.2.1 生物信息学软件 | 第67页 |
| 3.2.2 主要试剂 | 第67-68页 |
| 3.2.3 质粒、细胞和菌株 | 第68-69页 |
| 3.2.4 主要实验仪器和耗材 | 第69-70页 |
| 3.3 实验方法 | 第70-76页 |
| 3.3.1 PCR反应 | 第70-71页 |
| 3.3.2 PCR产物的纯化回收 | 第71页 |
| 3.3.3 产物与载体的连接 | 第71-72页 |
| 3.3.4 转化(热休克法) | 第72页 |
| 3.3.5 质粒的小量制备 | 第72-73页 |
| 3.3.6 阳性克隆的筛选与鉴定 | 第73页 |
| 3.3.7 测序 | 第73页 |
| 3.3.8 真核表达重组质粒的大量制备 | 第73-74页 |
| 3.3.9 常规细胞培养 | 第74-75页 |
| 3.3.10 荧光素酶报告系统分析 | 第75-76页 |
| 3.4 结果与分析 | 第76-82页 |
| 3.4.1 GATA4启动子分析 | 第76-77页 |
| 3.4.2 POP3与ATF4相互作用调控GATA4的荧光报告分析结果 | 第77-82页 |
| 第四章 讨论 | 第82-86页 |
| 参考文献 | 第86-89页 |
| 附录一 | 第89-91页 |
| 附录二 | 第91-92页 |
| 致谢 | 第92-93页 |
