| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 目录 | 第8-11页 |
| 1 前言 | 第11-26页 |
| 1.1 橡胶树概述 | 第11页 |
| 1.2 植物细胞悬浮培养 | 第11-16页 |
| 1.2.1 细胞悬浮培养影响因子 | 第13-15页 |
| 1.2.1.1 外植体和基因型 | 第13页 |
| 1.2.1.2 愈伤组织状态 | 第13页 |
| 1.2.1.3 培养基的种类、组成 | 第13-14页 |
| 1.2.1.4 培养条件和培养方式 | 第14-15页 |
| 1.2.1.5 PH值 | 第15页 |
| 1.2.2 橡胶树细胞悬浮培养 | 第15-16页 |
| 1.3 巴西橡胶树遗传转化研究进展 | 第16-17页 |
| 1.4 植物基因工程研究进展 | 第17-20页 |
| 1.4.1 基因枪法 | 第17页 |
| 1.4.2 农杆菌介导法 | 第17-18页 |
| 1.4.3 电激法 | 第18页 |
| 1.4.4 花粉管通道法 | 第18-19页 |
| 1.4.5 PEG法 | 第19页 |
| 1.4.6 显微注射法 | 第19页 |
| 1.4.7 其他转化方法 | 第19-20页 |
| 1.5 转基因植物生物安全性与转化单元的关系 | 第20-22页 |
| 1.5.1 启动子的安全性 | 第20-21页 |
| 1.5.2 标记基因的安全性 | 第21页 |
| 1.5.3 载体框架序列的安全性 | 第21-22页 |
| 1.6 转基因植物生物安全性的研究现状 | 第22-25页 |
| 1.6.1 共转化 | 第22-23页 |
| 1.6.2 转座子法 | 第23-24页 |
| 1.6.3 位点特异性重组系统法 | 第24页 |
| 1.6.4 "清洁"载体转化系统构思的提出 | 第24-25页 |
| 1.7 本研究的目的和意义 | 第25-26页 |
| 2 材料与方法 | 第26-37页 |
| 2.1 实验材料 | 第26页 |
| 2.2 培养基与培养条件 | 第26页 |
| 2.3 细胞悬浮系再生体系的建立 | 第26-28页 |
| 2.3.1 细胞悬浮系长期继代培养 | 第26页 |
| 2.3.2 悬浮细胞诱导易碎胚性愈伤组织 | 第26-27页 |
| 2.3.3 体细胞胚的诱导和成熟 | 第27页 |
| 2.3.4 植株再生 | 第27-28页 |
| 2.4 电激转化体系的建立及优化 | 第28-33页 |
| 2.4.1 环形质粒和相应线性表达框的获得 | 第28-31页 |
| 2.4.1.1 环形质粒p35S-EGFP的制备 | 第28-29页 |
| 2.4.1.2 线性EGFP表达框的制备 | 第29-30页 |
| 2.4.1.3 PCR产物回收 | 第30-31页 |
| 2.4.2 电激法转化 | 第31-33页 |
| 2.4.2.1 电激缓冲液配方 | 第31页 |
| 2.4.2.2 电激转化操作步骤 | 第31-32页 |
| 2.4.2.3 瞬时表达率的测定 | 第32页 |
| 2.4.2.4 细胞成活率的测定 | 第32页 |
| 2.4.2.5 U_(18)(18~1×6~2×3~4)均匀设计优化电激影响因数 | 第32-33页 |
| 2.5 电激共转化研究 | 第33-35页 |
| 2.5.1 质粒p35S-HbCBF1,p35S-GUS,p2301-HbCBF1的制备 | 第33页 |
| 2.5.2 线性GUS,KANA,HbCBF1表达框的制备 | 第33页 |
| 2.5.3 L_(16)(4~5)正交设计优化PCR参数 | 第33-34页 |
| 2.5.4 电激共转化 | 第34页 |
| 2.5.5 KANA选择压对转化的影响 | 第34页 |
| 2.5.6 KANA压选择方法对转化的影响 | 第34-35页 |
| 2.6 转化愈伤的鉴定 | 第35-37页 |
| 2.6.1 转化愈伤EGFP观察 | 第35页 |
| 2.6.2 转化愈伤基因组DNA提取 | 第35页 |
| 2.6.3 基因组DNA的PCR扩增 | 第35-37页 |
| 3 结果与分析 | 第37-57页 |
| 3.1 胚性细胞悬浮系的继代培养观察 | 第37-38页 |
| 3.2 易碎胚性愈伤组织诱导 | 第38-39页 |
| 3.3 胚性细胞悬浮系与易碎愈伤组织系的保持与增殖 | 第39页 |
| 3.4 体细胞的诱导和成熟 | 第39-42页 |
| 3.5 植株的再生 | 第42页 |
| 3.6 电激转化体系优化研究 | 第42-50页 |
| 3.6.1 环形质粒的获得 | 第42-43页 |
| 3.6.2 线性表达框的制备 | 第43-44页 |
| 3.6.3 电激参数均匀设计试验结果分析 | 第44-50页 |
| 3.6.3.1 试验指标的测定结果 | 第44页 |
| 3.6.3.2 试验结果的回归分析 | 第44-45页 |
| 3.6.3.3 验证性试验 | 第45-47页 |
| 3.6.3.4 回归方程的预测能力分析 | 第47页 |
| 3.6.3.5 不同电激缓冲液EGFP瞬时表达研究 | 第47-50页 |
| 3.6.3.6 悬浮细胞不同状态下研究 | 第50页 |
| 3.7 电激共转化研究 | 第50-54页 |
| 3.7.1 PCR参数正交设计试验结果分析 | 第50-51页 |
| 3.7.2 选择压浓度和方法对转化的影响 | 第51-54页 |
| 3.8 转化愈伤的鉴定 | 第54-57页 |
| 3.8.1 转化愈伤EGFP观察 | 第54页 |
| 3.8.2 PCR鉴定转化愈伤 | 第54-57页 |
| 4 讨论 | 第57-62页 |
| 4.1 细胞悬浮系长期继代培养 | 第57页 |
| 4.2 悬浮细胞诱导易碎胚性愈伤组织 | 第57-58页 |
| 4.3 体细胞胚的诱导和成熟 | 第58页 |
| 4.4 植株再生 | 第58-59页 |
| 4.5 电激转化的建立及优化 | 第59-60页 |
| 4.6 电激共转化研究 | 第60-62页 |
| 5 结论 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-71页 |
| 附表1 | 第71-72页 |
| 附表2 | 第72-73页 |
| 缩略词 | 第73-74页 |
| 致谢 | 第74页 |
