| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 论文缩写词表 | 第10-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-27页 |
| 1.1 血栓病给人类健康构成极大的威胁 | 第12页 |
| 1.2 溶血栓药物的种类 | 第12-14页 |
| 1.3 reteplase组织型纤溶酶原激活剂变异体结构 | 第14-16页 |
| 1.4 reteplase研究进展 | 第16-17页 |
| 1.4 包涵体蛋白复性研究进展 | 第17-23页 |
| 1.4.1 包涵体的形成机制研究 | 第17页 |
| 1.4.2 包涵体的洗涤溶解 | 第17-18页 |
| 1.4.3 蛋白质的折叠机理 | 第18-19页 |
| 1.4.4 二硫键在蛋白质正确折叠中的作用 | 第19-20页 |
| 1.4.5 蛋白质复性方法 | 第20-23页 |
| 1.4.5.1 稀释复性 | 第20页 |
| 1.4.5.2 透析复性 | 第20-21页 |
| 1.4.5.3 色谱复性 | 第21页 |
| 1.4.5.4 疏水色谱复性 | 第21页 |
| 1.4.5.5 介质吸附复性 | 第21-22页 |
| 1.4.5.6 分子伴侣辅助蛋白质复性 | 第22页 |
| 1.4.5.7 对含二硫键的蛋白复性 | 第22-23页 |
| 1.4.5.8 其它复性方法 | 第23页 |
| 1.5 Trx与含二硫键蛋白融合表达增加蛋白的可溶性 | 第23-24页 |
| 1.6 本课题拟解决的问题 | 第24页 |
| 参考文献 | 第24-27页 |
| 第二章 Escherichia coli pTPA_3／BL21的表达条件的优化 | 第27-35页 |
| 2.1 材料和仪器 | 第27-28页 |
| 2.1.1 试剂 | 第27页 |
| 2.1.2 仪器与设备 | 第27-28页 |
| 2.1.3 菌株 | 第28页 |
| 2.1.4 培养基 | 第28页 |
| 2.2 实验方法 | 第28-29页 |
| 2.2.1 发酵罐培养 | 第28页 |
| 2.2.2 包涵体洗涤 | 第28-29页 |
| 2.2.3 包涵体的溶解 | 第29页 |
| 2.2.4 超声波法辅助包涵体溶解 | 第29页 |
| 2.2.5 蛋白浓度测定Bradford检测法 | 第29页 |
| 2.2.6 其他检测方法 | 第29页 |
| 2.3 结果 | 第29-33页 |
| 2.3.1 IPTG浓度的影响 | 第29-30页 |
| 2.3.2 诱导时间的确定 | 第30-31页 |
| 2.3.3 葡萄糖浓度对目的蛋白表达率的影响 | 第31-32页 |
| 2.3.4 诱导后提高培养温度 | 第32页 |
| 2.3.5 包涵体的表达及洗涤 | 第32-33页 |
| 4 讨论 | 第33-34页 |
| 5 小结 | 第34页 |
| 参考文献 | 第34-35页 |
| 第三章 Reteplase蛋白的复性 | 第35-51页 |
| 3.1 材料与仪器 | 第35-37页 |
| 3.1.1 试剂 | 第35-36页 |
| 3.1.2 主要实验仪器 | 第36-37页 |
| 3.2 实验方法 | 第37-39页 |
| 3.2.1 稀释复性 | 第37页 |
| 3.2.2 PDI辅助蛋白复性 | 第37页 |
| 3.2.3 SEC辅助Reteplase蛋白复性 | 第37-38页 |
| 3.2.4 ETI亲和树脂的制备 | 第38-39页 |
| 3.2.5 ETI亲和层析纯化r-PA | 第39页 |
| 3.2.7 其他分析方法 | 第39页 |
| 3.3 结果 | 第39-48页 |
| 3.3.1 稀释复性 | 第39-40页 |
| 3.3.2 PDI辅助蛋白复性 | 第40-41页 |
| 3.3.3 色谱法辅助复性 | 第41-47页 |
| 3.3.3.1 无梯度层析柱复性蛋白 | 第42-43页 |
| 3.3.3.2 pH梯度层析柱复性蛋白 | 第43-44页 |
| 3.3.3.3 GuHCl梯度层析柱复性蛋白 | 第44-46页 |
| 3.3.3.4 pH、盐酸胍梯度双梯度凝胶复性蛋白 | 第46-47页 |
| 3.3.4 不同方法复性率的比较 | 第47页 |
| 3.3.5 ETI亲和层析纯化reteplase | 第47-48页 |
| 3.5 结果与讨论 | 第48-50页 |
| 3.6 小结 | 第50页 |
| 参考文献 | 第50-51页 |
| 第四章 reteplase融合蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第51-63页 |
| 4.1 材料与仪器 | 第51-52页 |
| 4.1.1 菌株及质粒 | 第51页 |
| 4.1.2 试剂 | 第51-52页 |
| 4.1.3 主要仪器 | 第52页 |
| 4.1.4 培养基 | 第52页 |
| 4.2 实验方法 | 第52-60页 |
| 4.2.1 Escherichia coli工程菌的构建 | 第52-56页 |
| 4.2.1.1 PCR扩增 | 第52-53页 |
| 4.2.1.2 琼脂糖电泳检测产物 | 第53页 |
| 4.2.1.3 PCR产物和质粒的酶切反应 | 第53页 |
| 4.2.1.4 PCR产物和质粒的连接反应 | 第53页 |
| 4.2.1.5 BL21(DE3)感受态细胞的制备 | 第53页 |
| 4.2.1.6 感受态细胞的转化 | 第53-54页 |
| 4.2.1.7 菌落PCR法挑取阳性克隆 | 第54页 |
| 4.2.1.8 基因序列测定 | 第54页 |
| 4.2.1.9 Reteplase的表达 | 第54-55页 |
| 4.2.1.10 免疫印迹(Western-Blot assay)鉴定 | 第55页 |
| 4.2.1.11 金属螯合层析 | 第55页 |
| 4.2.1.12 蛋白浓度的测定 | 第55-56页 |
| 4.2.2.13 r-PA活性测定 | 第56页 |
| 4.3.1 PCR扩增法克隆reteplase cDNA | 第56页 |
| 4.3.2 reteplase表达质粒的构建 | 第56-58页 |
| 4.3.3 基因序列测定 | 第58页 |
| 4.3.4 阳性克隆的挑选 | 第58页 |
| 4.3.5 reteplase的表达 | 第58-59页 |
| 4.3.6 免疫印迹(Western-Blot)鉴定 | 第59-60页 |
| 4.3.7 reteplase的纯化和生物学活性测定 | 第60页 |
| 4.4 讨论 | 第60-61页 |
| 4.5 小结 | 第61页 |
| 参考文献 | 第61-63页 |
| 致谢 | 第63-64页 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 | 第64-65页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第65页 |
