| 中文摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第一章 大肠杆菌原核表达外源基因的研究 | 第10-21页 |
| 1.1 pET表达系统 | 第10-11页 |
| 1.1.1 表达宿主菌 | 第11页 |
| 1.1.2 表达载体 | 第11页 |
| 1.2 融合标签 | 第11-12页 |
| 1.3 原核表达的诱导方式 | 第12-14页 |
| 1.3.1 蛋白表达的IPTG诱导 | 第12-13页 |
| 1.3.2 采用自动诱导的方式表达外源蛋白 | 第13-14页 |
| 1.4 大肠杆菌表达外源蛋白的几种策略 | 第14-16页 |
| 1.4.1 细胞质表达 | 第14-15页 |
| 1.4.2 表达蛋白分泌到周质空间 | 第15-16页 |
| 1.4.3 重组蛋白分泌到胞外培养基 | 第16页 |
| 1.5 提高重组蛋白周质分泌的策略 | 第16-18页 |
| 1.5.1 改造信号肽 | 第16-17页 |
| 1.5.2 选择适当的启动子 | 第17页 |
| 1.5.3 基因表达调控 | 第17页 |
| 1.5.4 共表达分子伴侣 | 第17-18页 |
| 1.6 大肠杆菌周质蛋白提取方法 | 第18-19页 |
| 1.6.1 渗透压休克法 | 第18页 |
| 1.6.2 溶菌酶法 | 第18页 |
| 1.6.3 其他提取方法 | 第18-19页 |
| 1.7 实验流程 | 第19页 |
| 1.7.1 克隆 | 第19页 |
| 1.7.2 转化 | 第19页 |
| 1.7.3 诱导表达 | 第19页 |
| 1.7.4 目的蛋白的纯化 | 第19页 |
| 1.7.5 质谱鉴定 | 第19页 |
| 1.7.6 全细胞膜片钳检测表达蛋白的生物活性 | 第19页 |
| 1.8 蜘蛛肽类毒素表达的问题与展望 | 第19-21页 |
| 第二章 诱导HNTX-Ⅳ的原核表达 | 第21-40页 |
| 前言 | 第21-22页 |
| 2.1 材料 | 第22-26页 |
| 2.1.1 载体和菌株 | 第22-23页 |
| 2.1.2 试剂和其他材料 | 第23页 |
| 2.1.3 培养基及其有关溶液 | 第23-24页 |
| 2.1.4 缓冲液 | 第24-26页 |
| 2.2 方法 | 第26-33页 |
| 2.2.1 引物设计 | 第26页 |
| 2.2.2 基因克隆 | 第26-29页 |
| 2.2.3 大肠杆菌感受态的制备 | 第29页 |
| 2.2.4 大肠杆菌的转化 | 第29页 |
| 2.2.5 阳性克隆的菌落PCR筛选 | 第29-30页 |
| 2.2.6 融合蛋白的自动诱导表达与SDS-PAGE鉴定 | 第30页 |
| 2.2.7 低渗处理离心下来的菌体 | 第30页 |
| 2.2.8 镍柱亲和层析 | 第30-31页 |
| 2.2.9 酶切去除融合标签 | 第31页 |
| 2.2.10 SDS-PAGE鉴定 | 第31-32页 |
| 2.2.11 C18反相柱层析纯化 | 第32页 |
| 2.2.12 质谱鉴定 | 第32页 |
| 2.2.13 毒素的电生理活性检测 | 第32-33页 |
| 2.3 结果与分析 | 第33-37页 |
| 2.3.1 表达载体的构建 | 第33-35页 |
| 2.3.2 重组海南毒素Ⅳ的表达与鉴定 | 第35页 |
| 2.3.3 重组海南毒素Ⅳ的分离与纯化 | 第35-36页 |
| 2.3.4 质谱鉴定 | 第36页 |
| 2.3.5 重组海南毒素Ⅳ的生理活性鉴定 | 第36-37页 |
| 2.4 讨论 | 第37-40页 |
| 参考文献 | 第40-46页 |
| 缩写表 | 第46-47页 |
| 致谢 | 第47-49页 |