| 中文摘要 | 第1-9页 |
| 英文摘要 | 第9-11页 |
| 引言 | 第11-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-24页 |
| 1 BLG研究概况 | 第12-14页 |
| ·β-乳球蛋白的分子结构 | 第12页 |
| ·β-乳球蛋白的致敏性 | 第12-13页 |
| ·消除BLG的致敏性的研究方法 | 第13-14页 |
| ·高压酶解法消除BLG的致敏性 | 第13页 |
| ·高温消除BLG的致敏性 | 第13-14页 |
| ·其他方法 | 第14页 |
| 2 RNAi | 第14-20页 |
| ·RNAi的发现与发展 | 第14-15页 |
| ·RNAi的分子机制 | 第15-19页 |
| ·siRNA的设计 | 第16-17页 |
| ·siRNA的制备 | 第17-18页 |
| ·siRNA的转染 | 第18-19页 |
| ·RNAi技术的特点 | 第19-20页 |
| ·RNAi存在的若干问题及其前景展望 | 第20页 |
| 3 慢病毒介导的RNAi | 第20-22页 |
| ·慢病毒载体的组成成分 | 第20-21页 |
| ·慢病毒介导的RNAi的特点 | 第21-22页 |
| ·慢病毒载体安全性问题 | 第22页 |
| 4 本研究的目的意义 | 第22-24页 |
| 第二章 靶向山羊BLG基因shRNA表达载体的构建及干涉效率的检测 | 第24-44页 |
| 1 实验材料 | 第24-25页 |
| ·试验动物 | 第24页 |
| ·菌株、质粒 | 第24页 |
| ·网络资源及软件 | 第24-25页 |
| ·主要试剂 | 第25页 |
| ·仪器设备 | 第25页 |
| 2 实验方法 | 第25-36页 |
| ·山羊胎儿皮肽成纤维细胞的培养 | 第25-26页 |
| ·山羊胎儿皮肤成纤维细胞的原代培养 | 第25-26页 |
| ·山羊胎儿皮肤成纤维细胞的传代培养 | 第26页 |
| ·山羊胎儿皮肤成纤维细胞的冻存 | 第26页 |
| ·山羊胎儿皮肤成纤维细胞的复苏 | 第26页 |
| ·山羊BLG基因shRNA真核表达载体构建 | 第26-27页 |
| ·靶向山羊BLG基因shRNA序列设计 | 第26-27页 |
| ·BLG基因真核表达载体N1-BLG的构建 | 第27-35页 |
| ·目的基因的获得 | 第27-29页 |
| ·PCR扩增BLG基因的ORF,酶切回收 | 第29-30页 |
| ·pEGFP-N1载体骨架的酶切回收 | 第30-31页 |
| ·目的片段BLG和载体骨架pEGFP-N1的连接 | 第31-32页 |
| ·转化 | 第32页 |
| ·质粒的提取 | 第32-33页 |
| ·PCR鉴定N1-BLG | 第33-34页 |
| ·酶切鉴定 | 第34-35页 |
| ·RT-PCR定量分析shRNA表达载体对BLG干扰效率 | 第35-36页 |
| 3. 结果 | 第36-42页 |
| ·PCR扩增BLG基因的ORF | 第36-37页 |
| ·pEGFP-N1载体骨架的酶切回收 | 第37页 |
| ·PCR鉴定连接产物N1-BLG | 第37-39页 |
| ·酶切鉴定连接产物N1-BLG | 第39-40页 |
| ·real-time PCR定量分析结果 | 第40-42页 |
| 4 讨论 | 第42-43页 |
| 5 小结 | 第43-44页 |
| 第三章 慢病毒RNAi载体的构建及靶向BLG基因的山羊转基因细胞系的建立 | 第44-68页 |
| 1 实验材料 | 第44-45页 |
| ·菌株,质粒 | 第44页 |
| ·主要试剂 | 第44页 |
| ·仪器设备 | 第44-45页 |
| 2 实验方法 | 第45-55页 |
| ·293FT细胞的培养 | 第45-46页 |
| ·细胞解冻 | 第45页 |
| ·细胞传代 | 第45页 |
| ·细胞冻存 | 第45-46页 |
| ·慢病毒RNAi载体的构建 | 第46-51页 |
| ·慢病毒转运载体plenti-Lacz骨架的构建 | 第46-47页 |
| ·shRNA表达框架的回收纯化 | 第47-49页 |
| ·shRNA2表达框架和慢病毒载体plenti-Lacz骨架的连接 | 第49-50页 |
| ·PCR鉴定plenti-Lacz-shRNA | 第50-51页 |
| ·酶切鉴定plenti-Lacz-shRNA | 第51页 |
| ·慢病毒包装质粒的扩增鉴定 | 第51页 |
| ·病毒的生产 | 第51-52页 |
| ·Blasticidin筛选慢病毒shRNA整合的细胞系 | 第52-53页 |
| ·Blasticidin的浓度筛选方法 | 第52页 |
| ·病毒感染山羊的胎儿成纤维细胞 | 第52-53页 |
| ·PCR鉴定慢病毒shRNA整合的细胞系 | 第53-54页 |
| ·定量分析山羊BLG的mRNA的相对表达量 | 第54-55页 |
| 3. 结果 | 第55-66页 |
| ·慢病毒shRNA载体的构建 | 第55-60页 |
| ·慢病毒转运载体plenti-Lacz骨架的构建 | 第55-56页 |
| ·shRNA表达框架的回收纯化 | 第56-57页 |
| ·PCR鉴定连接产物 | 第57-60页 |
| ·酶切鉴定连接产物plenti-Lacz-shRNA2 | 第60页 |
| ·病毒的生产 | 第60-61页 |
| ·病毒包装质粒的扩增鉴定 | 第60-61页 |
| ·Blasticidin最小致死量的确定 | 第61-62页 |
| ·病毒感染山羊的胎儿成纤维细胞并筛选阳性细胞系 | 第62-63页 |
| ·PCR鉴定慢病毒shRNA整合的细胞系 | 第63-65页 |
| ·real-time PCR定量分析结果 | 第65-66页 |
| 4 讨论 | 第66-67页 |
| 5 小结 | 第67-68页 |
| 论文总体结论 | 第68-70页 |
| 参考文献 | 第70-76页 |
| 致谢 | 第76页 |
