| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 前言 | 第10-18页 |
| 1.1 (R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(R)-HPBE) | 第10页 |
| 1.2 合成(R)-HPBE的方法 | 第10-13页 |
| 1.2.1 化学法 | 第10-11页 |
| 1.2.2 生物法合成 | 第11-13页 |
| 1.2.2.1 生物拆分法 | 第11-12页 |
| 1.2.2.2 生物还原法 | 第12-13页 |
| 1.3 工业规模的(R)-HPBE生产 | 第13-14页 |
| 1.4 辅酶循环 | 第14-15页 |
| 1.5 毕赤酵母 | 第15-16页 |
| 1.5.1 毕赤酵母表达体系,高密度发酵 | 第15-16页 |
| 1.5.2 还原酶在毕赤酵母中的表达 | 第16页 |
| 1.6 本课题的研究目的及意义 | 第16-17页 |
| 1.7 本论文的主要研究内容 | 第17-18页 |
| 第2章 酮还原酶CgKR2在毕赤酵母中的克隆表达 | 第18-29页 |
| 2.1 引言 | 第18页 |
| 2.2 材料与方法 | 第18-24页 |
| 2.2.1 主要试剂 | 第18页 |
| 2.2.2 主要仪器 | 第18-19页 |
| 2.2.3 培养基 | 第19-20页 |
| 2.2.4 菌种及质粒 | 第20页 |
| 2.2.5 分析方法 | 第20-21页 |
| 2.2.5.1 酶活测定方法 | 第20-21页 |
| 2.2.5.2 蛋白浓度检测 | 第21页 |
| 2.2.5.3 底物产物检测 | 第21页 |
| 2.2.6 实验方法 | 第21-24页 |
| 2.2.6.1 CgKR2引物设计 | 第21-22页 |
| 2.2.6.2 CgKR2 PCR扩增 | 第22页 |
| 2.2.6.3 酵母重组质粒的构建 | 第22-23页 |
| 2.2.6.4 毕赤酵母感受态制备及电转化 | 第23页 |
| 2.2.6.5 高拷贝筛选及验证 | 第23-24页 |
| 2.2.6.6 重组酵母表达CgKR2 | 第24页 |
| 2.3 结果和讨论 | 第24-28页 |
| 2.3.1 质粒和菌种构建 | 第25-26页 |
| 2.3.2 重组菌摇瓶培养 | 第26-28页 |
| 2.4 本章小结 | 第28-29页 |
| 第3章 重组细胞培养及纯化表征 | 第29-38页 |
| 3.1 引言 | 第29页 |
| 3.2 材料与方法 | 第29-32页 |
| 3.2.1 主要试剂 | 第29页 |
| 3.2.2 主要仪器 | 第29页 |
| 3.2.3 分析方法 | 第29页 |
| 3.2.4 胞内表达重组酵母细胞的培养及蛋白的Ni柱纯化 | 第29-30页 |
| 3.2.4.1 细胞培养 | 第29页 |
| 3.2.4.2 胞内重组CgKR2的纯化 | 第29-30页 |
| 3.2.4.3 使用的培养基和buffer | 第30页 |
| 3.2.5 胞外表达重组酵母细胞的培养及蛋白纯化 | 第30-31页 |
| 3.2.5.1 细胞培养 | 第30页 |
| 3.2.5.2 胞外分泌CgKR2的纯化 | 第30页 |
| 3.2.5.3 使用的培养基和buffer | 第30-31页 |
| 3.2.6 温度对酵母表达CgKR2的影响 | 第31页 |
| 3.2.7 pH对酵母表达CgKR2的影响 | 第31页 |
| 3.2.8 添加剂对对酵母表达CgKR2影响 | 第31页 |
| 3.2.9 CgKR2对底物OPBE动力学参数测定 | 第31页 |
| 3.2.10 纯化后CgKR2对底物OPBE选择性检测 | 第31-32页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第32-36页 |
| 3.3.1 重组CgKR2的纯化 | 第32-33页 |
| 3.3.2 温度对CgKR2的影响 | 第33页 |
| 3.3.3 pH对酶活的影响 | 第33-34页 |
| 3.3.4 金属离子及EDTA对酮还原酶CgKR2的影响 | 第34-35页 |
| 3.3.5 有机溶剂对CgKR2的影响 | 第35页 |
| 3.3.6 CgKR2对底物OPBE的动力学参数 | 第35-36页 |
| 3.3.7 重组蛋白对OPBE的选择性 | 第36页 |
| 3.4 本章小结 | 第36-38页 |
| 第4章 毕赤酵母重组菌的高密度发酵 | 第38-48页 |
| 4.1 引言 | 第38页 |
| 4.2 材料与方法 | 第38-40页 |
| 4.2.1 主要试剂和仪器 | 第38页 |
| 4.2.2 分析方法 | 第38-39页 |
| 4.2.3 分泌表达摇瓶水平优化 | 第39页 |
| 4.2.4 发酵罐培养 | 第39-40页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第40-47页 |
| 4.3.1 分泌表达摇瓶实验结果 | 第40页 |
| 4.3.2 分泌表达发酵罐实验结果 | 第40-44页 |
| 4.3.3 胞内表达发酵 | 第44-47页 |
| 4.4 本章小结 | 第47-48页 |
| 第5章 酵母表达CgKR2催化合成(R)-HPBE的研究 | 第48-54页 |
| 5.1 引言 | 第48页 |
| 5.2 材料与方法 | 第48-49页 |
| 5.2.1 主要试剂和仪器 | 第48页 |
| 5.2.2 分析方法 | 第48页 |
| 5.2.3 10mL体系催化反应优化 | 第48-49页 |
| 5.2.4 500mL体系胞内表达整细胞催化1 M反应 | 第49页 |
| 5.2.5 100mL体系分泌上清催化0.5 M反应 | 第49页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第49-53页 |
| 5.3.1 10mL体系催化反应优化 | 第49-50页 |
| 5.3.2 500mL体系胞内表达整细胞催化1 M反应 | 第50-51页 |
| 5.3.3 100mL体系分泌上清催化0.5 M反应 | 第51-53页 |
| 5.4 本章小结 | 第53-54页 |
| 结论和展望 | 第54-56页 |
| 参考文献 | 第56-61页 |
| 附录 | 第61-63页 |
| 攻读硕士期间撰写的论文和专利 | 第63-64页 |
| 致谢 | 第64页 |
