| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 第一章 引言 | 第15-22页 |
| 1.1 蓝舌病绪论 | 第15-21页 |
| 1.1.1 概述 | 第15页 |
| 1.1.2 BT传播与流行情况 | 第15-16页 |
| 1.1.3 BTV基因组及蛋白结构 | 第16页 |
| 1.1.4 BTV病毒粒子组装和释放 | 第16-17页 |
| 1.1.4.1 病毒外层衣壳的组装及在病毒吸附中的作用 | 第16-17页 |
| 1.1.4.2 病毒核心颗粒的组装 | 第17页 |
| 1.1.4.3 从感染细胞中释放子代病毒粒子 | 第17页 |
| 1.1.5 BTV非结构蛋白及其作用 | 第17-18页 |
| 1.1.6 BTV复制过程 | 第18页 |
| 1.1.7 BT发病症状及诊断 | 第18-19页 |
| 1.1.8 BT预防 | 第19-21页 |
| 1.1.8.1 灭活疫苗 | 第19-20页 |
| 1.1.8.2 弱毒疫苗 | 第20页 |
| 1.1.8.3 病毒样颗粒（VLP）和核心颗粒（CLP） | 第20页 |
| 1.1.8.4 重组载体疫苗 | 第20-21页 |
| 1.2 本研究目的及意义 | 第21-22页 |
| 第二章 BTV12 NS1蛋白的原核表达及鉴定 | 第22-28页 |
| 2.1 材料 | 第22页 |
| 2.1.1 原核表达载体、感受态细胞、病毒、重组质粒及主要试剂 | 第22页 |
| 2.2 方法 | 第22-24页 |
| 2.2.1 引物设计 | 第22页 |
| 2.2.2 BTV12 S5基因的原核表达载体构建 | 第22-23页 |
| 2.2.2.1 BTV12 S5基因的克隆鉴定 | 第22-23页 |
| 2.2.2.2 BTV12 S5基因和原核表达载体pET-30a的双酶切和连接转化 | 第23页 |
| 2.2.2.3 阳性重组质粒的鉴定 | 第23页 |
| 2.2.3 BTV12 NS1蛋白的原核表达及鉴定 | 第23-24页 |
| 2.2.4 原核表达BTV12重组NS1蛋白的纯化与鉴定 | 第24页 |
| 2.2.4.1 重组NS1蛋白的纯化 | 第24页 |
| 2.2.4.2 重组NS1蛋白的鉴定 | 第24页 |
| 2.3 实验结果 | 第24-27页 |
| 2.3.1 BTV12 S5基因的PCR扩增 | 第24-25页 |
| 2.3.2 重组质粒pET-NS1-BTV12的鉴定 | 第25-26页 |
| 2.3.3 BTV12 NS1蛋白原核表达的SDS-PAGE鉴定 | 第26页 |
| 2.3.4 重组NS1蛋白纯化后的SDS-PAGE和WB分析 | 第26-27页 |
| 2.4 讨论 | 第27-28页 |
| 第三章 BTV12 NS1蛋白的真核表达及鉴定 | 第28-36页 |
| 3.1 实验材料 | 第28页 |
| 3.1.1 杆状病毒表达载体、细胞、重组质粒及主要试剂 | 第28页 |
| 3.1.2 试剂配制 | 第28页 |
| 3.2 实验方法 | 第28-31页 |
| 3.2.1 引物设计 | 第28-29页 |
| 3.2.2 BTV12-S5 基因的克隆鉴定 | 第29页 |
| 3.2.3 BTV12 S5基因重组杆状病毒穿梭质粒pFAST-NS1-BTV12的构建 | 第29页 |
| 3.2.3.1 BTV12 S5基因和供体质粒pFastBacHT A的双酶切和连接 | 第29页 |
| 3.2.3.2 转化与重组穿梭质粒pFAST-NS1-BTV12的鉴定 | 第29页 |
| 3.2.4 重组杆粒的构建与鉴定 | 第29-30页 |
| 3.2.4.1 pFAST-NS1-BTV12转化感受态细胞DH10BacTM | 第29页 |
| 3.2.4.2 重组杆粒rBacmid DNA和空杆粒的提取 | 第29-30页 |
| 3.2.4.3 重组杆粒rBacmid DNA的PCR鉴定 | 第30页 |
| 3.2.5 重组杆状病毒的制备与扩增 | 第30-31页 |
| 3.2.5.1 转染细胞的准备 | 第30页 |
| 3.2.5.2 重组杆粒rBacmid DNA感染sf21细胞 | 第30页 |
| 3.2.5.3 重组杆状病毒的扩增与表达 | 第30-31页 |
| 3.2.6 Sf21昆虫细胞中重组NS1蛋白的表达与SDS-PAGE鉴定 | 第31页 |
| 3.2.7 真核重组NS1蛋白的纯化与Western Blot分析 | 第31页 |
| 3.2.7.1 真核重组NS1蛋白的切胶纯化 | 第31页 |
| 3.2.7.2 真核重组NS1蛋白的WB分析 | 第31页 |
| 3.3 实验结果 | 第31-34页 |
| 3.3.1 BTV12 S5基因的PCR扩增 | 第31-32页 |
| 3.3.2 重组杆状病毒穿梭质粒pFAST-NS1-BTV12的鉴定 | 第32-33页 |
| 3.3.3 重组杆粒rBacmid DNA的PCR鉴定 | 第33页 |
| 3.3.4 BTV12 S5基因在sf21昆虫细胞中的表达情况鉴定 | 第33-34页 |
| 3.3.5 WB分析纯化的真核重组NS1蛋白 | 第34页 |
| 3.4 讨论 | 第34-36页 |
| 第四章 BTV12 NS1蛋白MABS的制备及特性鉴定 | 第36-45页 |
| 4.1 实验材料 | 第36页 |
| 4.2 实验方法 | 第36-39页 |
| 4.2.1 免疫小鼠 | 第36页 |
| 4.2.2 间接ELISA检测方法的建立 | 第36页 |
| 4.2.3 细胞融合 | 第36-38页 |
| 4.2.3.1 SP2/0 骨髓瘤细胞的复苏培养 | 第37页 |
| 4.2.3.2 制备饲养层细胞 | 第37页 |
| 4.2.3.3 细胞融合 | 第37-38页 |
| 4.2.4 阳性杂交瘤细胞株的筛选 | 第38页 |
| 4.2.4.1 细胞融合后换液 | 第38页 |
| 4.2.4.2 间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株 | 第38页 |
| 4.2.5 阳性杂交瘤细胞的扩大培养、冻存 | 第38页 |
| 4.2.6 MAbs腹水的制备 | 第38页 |
| 4.2.7 MAbs及阳性杂交瘤细胞株的特性鉴定 | 第38-39页 |
| 4.2.7.1 WB鉴定 | 第38-39页 |
| 4.2.7.2 IFA鉴定 | 第39页 |
| 4.2.7.3 MAbs亚类鉴定 | 第39页 |
| 4.2.7.4 MAbs上清和腹水效价的测定 | 第39页 |
| 4.2.7.5 杂交瘤细胞株抗体分泌稳定性的测定 | 第39页 |
| 4.3 结果 | 第39-43页 |
| 4.3.1 间接ELISA检测方法的建立 | 第39-40页 |
| 4.3.2 阳性杂交瘤细胞株的筛选 | 第40页 |
| 4.3.3 WB鉴定MAbs及阳性杂交瘤细胞株 | 第40-43页 |
| 4.3.4 IFA鉴定 | 第43页 |
| 4.3.5 MAbs亚类鉴定 | 第43页 |
| 4.3.6 MAbs上清和腹水效价及杂交瘤细胞株抗体分泌稳定性的测定 | 第43页 |
| 4.4 讨论 | 第43-45页 |
| 第五章 BTV12 NS1蛋白抗原表位鉴定 | 第45-65页 |
| 5.1 实验材料 | 第45页 |
| 5.1.1 质粒、菌株、感受态细胞和主要试剂 | 第45页 |
| 5.2 实验方法 | 第45-52页 |
| 5.2.1 BTV12NS1蛋白截短表达 | 第45-52页 |
| 5.2.1.1 引物设计 | 第45-52页 |
| 5.2.1.2 55条短肽的截短表达 | 第52页 |
| 5.2.2 BTV12 NS1蛋白抗原表位的初步鉴定 | 第52页 |
| 5.2.3 BTV12 NS1蛋白抗原表位的特异性和保守性分析 | 第52页 |
| 5.3 实验结果 | 第52-65页 |
| 5.3.1 BTV12 NS1蛋白55条短肽的原核表达 | 第52-53页 |
| 5.3.2 抗原表位的初步鉴定 | 第53-55页 |
| 5.3.2.1 间接ELISA初步鉴定 | 第53-55页 |
| 5.3.2.2 WB验证 | 第55页 |
| 5.3.3 BTV12 NS1蛋白抗原表位的特异性和保守性分析 | 第55-65页 |
| 第六章 全文总结 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-71页 |
| 致谢 | 第71-72页 |
| 作者简历 | 第72页 |
