| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第一章 绪论 | 第13-27页 |
| 1.1 RNA结合蛋白质(RBPs) | 第13-16页 |
| 1.1.1 RNA结合蛋白质和转录后基因调控 | 第13页 |
| 1.1.2 多种多样的RNA结合蛋白(RBPs) | 第13-16页 |
| 1.1.3 RNA结合蛋白(RBPs)的功能多样性 | 第16页 |
| 1.2 KH结构域的结构与功能 | 第16-22页 |
| 1.2.1 K-同源(KH)结构域 | 第16-17页 |
| 1.2.2 KH结构域的两种折叠类型 | 第17-18页 |
| 1.2.3 KH结构域之间在进化上的关系 | 第18页 |
| 1.2.4 KH结构域结合核酸的一般特征 | 第18-21页 |
| 1.2.5 延伸的KH结构域 | 第21-22页 |
| 1.3 线虫MEX-3蛋白质 | 第22-24页 |
| 1.4 人源MEX-3C蛋白质 | 第24-27页 |
| 第二章 实验材料与实验方法 | 第27-55页 |
| 2.1 基因克隆 | 第27-33页 |
| 2.1.1 人源MEX-3C蛋白质KH结构域表达边界的选择 | 第27-28页 |
| 2.1.2 引物设计及PCR扩增 | 第28-29页 |
| 2.1.3 目的基因琼脂糖凝胶电泳鉴定 | 第29-30页 |
| 2.1.4 目的基因胶回收 | 第30页 |
| 2.1.5 pET28a-SUMO和P28质粒的提取 | 第30-31页 |
| 2.1.6 质粒与目的DNA片段双酶切 | 第31-32页 |
| 2.1.7 酶切产物回收 | 第32页 |
| 2.1.8 目的基因与载体连接反应 | 第32页 |
| 2.1.9 连接产物转化大肠杆菌 | 第32-33页 |
| 2.1.10 定点突变体的构建 | 第33页 |
| 2.2 蛋白质表达及纯化 | 第33-35页 |
| 2.2.1 目的蛋白质(KH1/2,KH1及KH2结构域)的表达 | 第33页 |
| 2.2.2 目的蛋白质的Ni-NTA亲和纯化 | 第33-34页 |
| 2.2.3 目的蛋白质凝胶过滤层析 | 第34-35页 |
| 2.2.4 SDS-PAGE电泳 | 第35页 |
| 2.3 晶体筛选和优化 | 第35-37页 |
| 2.4 等温滴定量热(ITC) | 第37-40页 |
| 2.4.1 等温滴定量热原理 | 第37-38页 |
| 2.4.2 RNA-蛋白质相互作用的等温量热滴定实验 | 第38-40页 |
| 2.5 圆二色谱(CD谱)实验检测突变体蛋白质的二级结构 | 第40-42页 |
| 2.6 荧光偏振实验(Fluorescence Polarization) | 第42-43页 |
| 2.7 核磁共振实验(NMR) | 第43-45页 |
| 2.7.1 ~(15)N-标记/~(13)C,~(15)N-标记的蛋白质样品的准备 | 第43页 |
| 2.7.2 KH1和KH2结构域的主链认证实验 | 第43-44页 |
| 2.7.3 NMR化学位移扰动实验 | 第44-45页 |
| 2.8 HLA-A2 3'UTR体外转录 | 第45-52页 |
| 2.8.1 体外RNA转录的模板 | 第45页 |
| 2.8.2 HLA-A2 3'UTR转录模板制备 | 第45-49页 |
| 2.8.3 HLA-A2 3'UTR体外50μl小转录 | 第49-50页 |
| 2.8.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定转录的RNA | 第50页 |
| 2.8.5 RNA体外10 ml大体积转录和纯化 | 第50-52页 |
| 2.9 HLA-A2 3'UTR 5'端Dylight-680荧光基团标记 | 第52-53页 |
| 2.10 凝胶电泳迁移实验(EMSA) | 第53-55页 |
| 第三章 人源MEX-3C蛋白质K-homology (KH)结构域的结构与功能研究 | 第55-93页 |
| 3.1 引言 | 第55页 |
| 3.2 实验结果 | 第55-91页 |
| 3.2.1 人源MEX-3C蛋白质串联KH1/2结构域的表达与纯化 | 第55-56页 |
| 3.2.2 人源MEX-3C蛋白质KH1/2结构域结合MRE10 RNA | 第56-58页 |
| 3.2.3 人源MEX-3C蛋白质单独的KH结构域保持RNA结合能力 | 第58-60页 |
| 3.2.4 人源MEX-3C蛋白质KH1和KH2结构域之间没有相互作用 | 第60-63页 |
| 3.2.5 apo-KH2、KH1-GUUUAG和KH2-CAGAGU的总体结构 | 第63-69页 |
| 3.2.6 人源MEX-3C蛋白质KH1和KH2结构域的RNA结合位点3和4拥有高度相似的相互作用界面 | 第69-72页 |
| 3.2.7 人源MEX-3C蛋白质KH1和KH2结构域其他位点的KH-RNA结合界面是不同的 | 第72-73页 |
| 3.2.8 串联的KH1/2结构域保持与单独的KH结构域相同的RNA识别模式 | 第73-79页 |
| 3.2.9 基于结构的氨基酸突变实验揭示了参与RNA结合的重要的氨基酸残基 | 第79-82页 |
| 3.2.10 人源MEX-3C蛋白质识别的RNA一致性序列 | 第82-86页 |
| 3.2.11 人源MEX-3C KH1/2结构域特异性地结合HLA-A2 mRNA | 第86-88页 |
| 3.2.12 与其他KH-核酸复合物的结构比较 | 第88-91页 |
| 3.3 小结与讨论 | 第91-93页 |
| 参考文献 | 第93-103页 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文与参加的学术会议 | 第103-105页 |
| 致谢 | 第105-106页 |
