| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5页 |
| 符号与缩略语说明 | 第10-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-19页 |
| 1.1 高电荷机械敏感通道蛋白(MscL)简介 | 第11页 |
| 1.2 MscL的研究进展 | 第11-14页 |
| 1.2.1 现有的MscL结构研究结果 | 第12-13页 |
| 1.2.2 MscL的表达和活化 | 第13页 |
| 1.2.3 生物学功能 | 第13-14页 |
| 1.2.4 MscL为克服抗药性提供新的可能 | 第14页 |
| 1.3 MscL低聚物形态的研究进展 | 第14-19页 |
| 1.3.1 研究进展 | 第15-19页 |
| 第二章 研究思路与实验设计 | 第19-23页 |
| 2.1 引言 | 第19页 |
| 2.2 研究思路 | 第19-20页 |
| 2.3 实验设计 | 第20-22页 |
| 2.3.1 构建表达载体 | 第20-21页 |
| 2.3.2 优化表达和大量表达 | 第21页 |
| 2.3.3 纯化 | 第21-22页 |
| 2.3.4 质谱分析 | 第22页 |
| 2.4 本章小结 | 第22-23页 |
| 第三章 表达载体的构建 | 第23-39页 |
| 3.1 引言 | 第23页 |
| 3.2 实验仪器设备与材料 | 第23-26页 |
| 3.2.1 仪器与主要设备 | 第23-24页 |
| 3.2.2 菌株和质粒 | 第24页 |
| 3.2.3 工具酶与试剂 | 第24-25页 |
| 3.2.4 主要试剂的配置方法 | 第25-26页 |
| 3.3 大肠杆菌的固体培养方法的建立 | 第26页 |
| 3.4 大肠杆菌的液体培养方法的建立 | 第26-27页 |
| 3.5 大肠杆菌基因组的提取 | 第27页 |
| 3.6 PCR方法扩增目的基因 | 第27-28页 |
| 3.6.1 设计引物 | 第28页 |
| 3.6.2 引物设计的方法 | 第28页 |
| 3.7 PCR反应 | 第28-30页 |
| 3.7.1 工具酶和试剂盒 | 第28-29页 |
| 3.7.2 分子量标准 | 第29页 |
| 3.7.3 PCR反应体系 | 第29-30页 |
| 3.8 DNA凝胶电泳验证PCR产物 | 第30-32页 |
| 3.8.1 DNA凝胶电泳试剂 | 第30页 |
| 3.8.2 实验步骤 | 第30-32页 |
| 3.8.3 PCR产物跑胶验证 | 第32页 |
| 3.9 PCR产物跑胶回收 | 第32-33页 |
| 3.10 构建目的基因的表达载体 | 第33-34页 |
| 3.10.1 将MscL片段插入到pET-28载体 | 第33-34页 |
| 3.11 扩增载体 | 第34-36页 |
| 3.11.1 DH5α大肠杆菌感受细胞的制备 | 第34-35页 |
| 3.11.2 表达载体转化到DH5α大肠杆菌感受细胞 | 第35页 |
| 3.11.3 提取质粒 | 第35-36页 |
| 3.12 质粒的验证 | 第36-38页 |
| 3.12.1 质粒酶切验证 | 第36-37页 |
| 3.12.2 质粒的测序验证 | 第37-38页 |
| 3.12.3 MscL+ThrxA质粒PCR验证 | 第38页 |
| 3.13 本章小结 | 第38-39页 |
| 第四章 大肠杆菌表达MscL蛋白研究方法的建立 | 第39-51页 |
| 4.1 引言 | 第39页 |
| 4.2 实验仪器设备与材料 | 第39-40页 |
| 4.2.1 仪器与主要设备 | 第39-40页 |
| 4.2.2 试剂 | 第40页 |
| 4.3 构建BL-21DE3 Tunner细胞表达体系 | 第40-41页 |
| 4.3.1 制备BL-21DE3 Tunner感受态细胞 | 第40-41页 |
| 4.3.2 转化质粒至BL-21感受态细胞 | 第41页 |
| 4.3.3 测绘大肠杆菌生长曲线 | 第41页 |
| 4.4 小量表达 | 第41-42页 |
| 4.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳验证 | 第42-46页 |
| 4.5.1 制作SDS-PAGE蛋白胶 | 第42-43页 |
| 4.5.2 蛋白样品的前处理 | 第43-44页 |
| 4.5.3 蛋白电泳操作 | 第44-46页 |
| 4.6 Dot-Blot验证 | 第46-48页 |
| 4.6.1 试剂 | 第46-48页 |
| 4.7 Western-Bolt验证 | 第48-50页 |
| 4.7.1 试剂 | 第48页 |
| 4.7.2 跑胶 | 第48-49页 |
| 4.7.3 湿转 | 第49-50页 |
| 4.8 本章小结 | 第50-51页 |
| 第五章 目的蛋白的大量表达和纯化 | 第51-63页 |
| 5.1 引言 | 第51页 |
| 5.2 实验仪器与材料 | 第51-52页 |
| 5.2.1 仪器与主要设备 | 第51-52页 |
| 5.2.2 试剂 | 第52页 |
| 5.3 大量表达操作 | 第52-53页 |
| 5.3.1 配制无菌LB液体培养基 | 第52-53页 |
| 5.4 上样前处理 | 第53-54页 |
| 5.5 亲和层析 | 第54-58页 |
| 5.5.1 镍柱平衡 | 第54页 |
| 5.5.2 蠕动泵上样 | 第54-55页 |
| 5.5.3 清洗 | 第55页 |
| 5.5.4 洗脱 | 第55页 |
| 5.5.5 再平衡 | 第55-58页 |
| 5.6 体积排阻层析 | 第58-62页 |
| 5.6.1 平衡 | 第58-59页 |
| 5.6.2 排气 | 第59页 |
| 5.6.3 进样 | 第59页 |
| 5.6.4 收集 | 第59-62页 |
| 5.7 本章小结 | 第62-63页 |
| 第六章 目的蛋白的质谱分析 | 第63-69页 |
| 6.1 引言 | 第63-64页 |
| 6.2 BCA法测定蛋白蛋白浓度 | 第64-66页 |
| 6.2.1 试剂与仪器 | 第64页 |
| 6.2.2 操作步骤 | 第64-66页 |
| 6.3 质谱分析 | 第66-68页 |
| 6.3.1 仪器与试剂 | 第66页 |
| 6.3.2 质谱上样针的制备 | 第66-67页 |
| 6.3.3 蛋白样品前处理 | 第67页 |
| 6.3.4 质谱上样 | 第67-68页 |
| 6.4 本章小结 | 第68-69页 |
| 第七章 总结和展望 | 第69-70页 |
| 致谢 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-80页 |
| 附录 | 第80页 |
