| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-12页 |
| 目录 | 第12-18页 |
| 第一章 引言 | 第18-37页 |
| 第一节 胚胎干细胞的研究进展 | 第18-29页 |
| ·胚胎干细胞的建系与定义 | 第18-19页 |
| ·胚胎干细胞的应用前景、遇到的问题及解决办法 | 第19-22页 |
| ·胚胎干细胞多能性的维持及分子调控机制 | 第22-26页 |
| ·胚胎干细胞的异质性 | 第26-29页 |
| 第二节 端粒 | 第29-34页 |
| ·端粒结构与功能 | 第29-30页 |
| ·端粒酶 | 第30页 |
| ·端粒异常与疾病 | 第30-31页 |
| ·端粒长度的调控机制 | 第31-33页 |
| ·端粒与胚胎干细胞 | 第33-34页 |
| ·端粒与肿瘤 | 第34页 |
| 第三节 本研究的目的和意义 | 第34-37页 |
| 第二章 Rif1维持胚胎干细胞中端粒长度稳定、多能性和自我更新能力 | 第37-86页 |
| 第一节 导言 | 第37-38页 |
| 第二节 实验材料与方法 | 第38-59页 |
| ·实验材料 | 第38-42页 |
| ·载体构建 | 第42-43页 |
| ·实验细胞系的建立 | 第43-45页 |
| ·短期及长期Rif1干扰细胞的基因表达谱分析 | 第45页 |
| ·实时定量荧光PCR检测基因表达 | 第45-48页 |
| ·Western blot | 第48-49页 |
| ·免疫荧光实验 | 第49-50页 |
| ·端粒定量荧光原位杂交(Q-FISH)检测端粒长度 | 第50-52页 |
| ·定量PCR方法检测不同细胞的端粒长度(T/S ratio) | 第52-53页 |
| ·染色单体定向荧光原位杂交(CO-FISH) | 第53页 |
| ·端粒酶活性分析 | 第53-54页 |
| ·端粒与损伤基因共定位 | 第54-55页 |
| ·细胞周期检测 | 第55页 |
| ·细胞衰老检测 | 第55-56页 |
| ·细胞增殖检测 | 第56页 |
| ·细胞分化检测细胞的多能性 | 第56-57页 |
| ·嵌合体老鼠及胚胎注射实验检测E12.5胚胎的荧光(EGFP) | 第57-58页 |
| ·数据分析 | 第58-59页 |
| 第三节 实验结果 | 第59-82页 |
| ·Rif1在ESC及睾丸中高表达 | 第59-61页 |
| ·稳定干扰Rif1后影响ES细胞的增殖、分化能力及多能性 | 第61-65页 |
| ·Rif1负向调节Zscan4等2细胞基因及Zscan4~+细胞比例 | 第65-73页 |
| ·稳定干扰Rif1引起端粒长度延长、端粒融合及端粒重组频率升高 | 第73-76页 |
| ·稳定干扰Rif1不引起ES细胞中端粒的损伤 | 第76-78页 |
| ·在稳定干扰Rif1的细胞中再次干扰Zscan4后能部分恢复细胞增殖能力、异常延长的端粒及高频率的T-SCE | 第78-79页 |
| ·Zscan4 KD能够部分恢复Rif1 KD引起的早期胚胎发育缺陷 | 第79-82页 |
| 第四节 讨论 | 第82-86页 |
| 第三章 Rif1通过维持异染色质沉默来调节Zscan4及端粒长度 | 第86-112页 |
| 第一节 导言 | 第86-87页 |
| 第二节 实验材料及方法 | 第87-96页 |
| ·实验材料 | 第87-89页 |
| ·载体构建 | 第89-90页 |
| ·启动子活性分析 | 第90-91页 |
| ·流式细胞仪检测Zscan4~+比例 | 第91页 |
| ·Western blot | 第91-92页 |
| ·免疫荧光 | 第92-93页 |
| ·ChIP-qPCR及数据分析 | 第93-96页 |
| ·ChIP-seq及数据分析 | 第96页 |
| ·免疫共沉淀(Co-IP) | 第96页 |
| 第三节 实验结果 | 第96-110页 |
| ·Rif1干扰后激活Zscan4启动子活性及Zscan4通过自身的SCAN结构域激活自身的启动子活性 | 第96-100页 |
| ·Rif1结合于端粒亚端粒区域 | 第100-101页 |
| ·Rif1干扰后H3K9me3的蛋白水平下降及在Zscan4启动子处结合量下降 | 第101-104页 |
| ·Rif1干扰后H3K9me3在基因组水平的结合大大降低 | 第104-106页 |
| ·Rifl通过稳定亚端粒异染色质区域H3K9甲基化水平来调控Zscan4的表达及端粒长度 | 第106-109页 |
| ·Rif1通过表观遗传调节Zscan4及端粒的模式图 | 第109-110页 |
| 第四节 讨论 | 第110-112页 |
| 第四章 Tbx3通过表观遗传途径调节小鼠胚胎干细胞中的端粒长度 | 第112-132页 |
| 第一节 导言 | 第112页 |
| 第二节 实验材料与方法 | 第112-118页 |
| ·实验材料 | 第113页 |
| ·载体构建 | 第113页 |
| ·细胞系的构建 | 第113-114页 |
| ·实时定量荧光PCR检测基因表达 | 第114-115页 |
| ·Western blot | 第115页 |
| ·免疫荧光实验 | 第115-116页 |
| ·体外三胚层分化实验 | 第116页 |
| ·流式细胞仪检测Zscan4~+的比例 | 第116页 |
| ·Zscan4启动子活性实验 | 第116页 |
| ·端粒定量荧光原位杂交(Q-FISH)检测端粒长度 | 第116页 |
| ·定量PCR方法检测不同细胞的端粒长度(T/S ratio) | 第116-117页 |
| ·细胞周期检测 | 第117页 |
| ·流式细胞仪检测基因组甲基化水平 | 第117-118页 |
| ·ChIP-qPCR及数据分析 | 第118页 |
| 第三节 实验结果 | 第118-129页 |
| ·Tbx3是一个新的ES 2细胞状态调节因子 | 第119-121页 |
| ·Tbx3 OE稳定细胞系的构建 | 第121-122页 |
| ·Tbx3 OE不影响ES细胞的多能性及体外分化能力 | 第122-123页 |
| ·Tbx3 OE延长端粒长度 | 第123-125页 |
| ·Tbx3 OE激活Zscan4的表达及启动子活性 | 第125-126页 |
| ·Tbx3不直接结合于Zscan4基因的启动子 | 第126页 |
| ·Tbx3通过调节基因组DNA甲基化水平来调节Zscan4的表达 | 第126-129页 |
| 第四节 讨论 | 第129-132页 |
| 第五章 组蛋白乙酰化水平调节小鼠胚胎干细胞的端粒长度 | 第132-140页 |
| 第一节 导言 | 第132页 |
| 第二节 实验材料与方法 | 第132-134页 |
| ·实验材料 | 第132-133页 |
| ·实时定量荧光PCR检测基因表达 | 第133页 |
| ·Western blot | 第133-134页 |
| ·流式细胞仪检测Zscan4~+的比例 | 第134页 |
| ·Zscan4启动子活性实验 | 第134页 |
| ·端粒定量荧光原位杂交(Q-FISH)检测端粒长度 | 第134页 |
| 第三节 实验结果 | 第134-139页 |
| ·组蛋白乙酰化水平调控端粒长度的变化 | 第134-135页 |
| ·在Terc~(-/-) G1 ESC中组蛋白乙酰化水平也调控端粒长度的变化 | 第135-136页 |
| ·组蛋白乙酰化水平通过调节Zscan4等2细胞基因的表达调节端粒长度 | 第136-139页 |
| 第四节 讨论 | 第139-140页 |
| 第六章 端粒酶缺失的小鼠胚胎干细胞及人肿瘤细胞中维持端粒长度稳定的分子机制 | 第140-173页 |
| 第一节 导言 | 第140-142页 |
| 第二节 实验材料与方法 | 第142-149页 |
| ·实验材料 | 第142页 |
| ·载体构建 | 第142页 |
| ·实验用细胞系的构建 | 第142-143页 |
| ·实时定量荧光PCR检测基因表达 | 第143-144页 |
| ·Western blot | 第144-145页 |
| ·免疫荧光实验及数据统计分析 | 第145页 |
| ·细胞周期检测 | 第145页 |
| ·细胞增殖能力检测 | 第145页 |
| ·Zscan4启动子活性实验 | 第145-146页 |
| ·端粒定量荧光原位杂交(Q-FISH)检测端粒长度 | 第146页 |
| ·定量PCR方法检测不同细胞的端粒长度(T/S ratio) | 第146页 |
| ·TRF检测端粒长度 | 第146-147页 |
| ·流式细胞仪检测基因组甲基化水平 | 第147页 |
| ·亚硫酸盐测序 | 第147-149页 |
| 第三节 实验结果 | 第149-169页 |
| ·G4 Terc~(-/-)ESC 中端粒维持稳定的长度而WT ESC中端粒在培养过程中是延长的 | 第149-152页 |
| ·端粒大为缩短的G4 Terc~(-/-) ESC中增殖能力下降 | 第152-153页 |
| ·Zscan4在G4 Terc~(-/-) ESC中高表达 | 第153-154页 |
| ·在G4 Terc~(-/-) ESC中干扰Zscan4后端粒缩短及生长变慢 | 第154-155页 |
| ·G4 Terc~(-/-) ESC中亚端粒区域甲基化水平下降 | 第155-160页 |
| ·G4 Tere~(-/-) ESC中H3K9me3水平下降、AcH3水平升高 | 第160-162页 |
| ·在WT ESC用小分子药物抑制剂介导DNA及H3K9me3的下降能激活Zscan4的表达及延长端粒 | 第162-164页 |
| ·人ZSCAN4基因同样能维持端粒酶缺失的人肿瘤细胞的端粒长度 | 第164-168页 |
| ·人端粒酶缺失的肿瘤细胞利用与G4 Terc~(-/-)相似的机制来激活ZSCAN4基因的表达 | 第168-169页 |
| 第四节 讨论 | 第169-173页 |
| 第七章 结论与展望 | 第173-177页 |
| 附录A 中英文缩略词 | 第177-179页 |
| 参考文献 | 第179-195页 |
| 致谢 | 第195-197页 |
| 个人简历 在学期间发表的学术论文及研究成果 | 第197-198页 |
