| 目录 | 第1-8页 |
| 摘要 | 第8-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 縮略语表 | 第11-12页 |
| 第一章 引言 | 第12-31页 |
| 1 结核分枝杆菌耐药机制研究进展 | 第12-30页 |
| ·结核病治疗现状 | 第12-15页 |
| ·结核病临床药物作用机理和耐药机理研究 | 第15-19页 |
| ·结核病临床药物作用机理研究 | 第15-16页 |
| ·结核病临床菌株耐药机理研究 | 第16-19页 |
| ·结核分枝杆菌对氨基水杨酸作用机理和耐药机理研究 | 第19-30页 |
| ·对氨基水杨酸起源和特性 | 第19-21页 |
| ·对氨基水杨酸作用机理与铁离子代谢 | 第21-30页 |
| 2 本研究的目的和意义 | 第30-31页 |
| 第二章 结核分枝杆菌对氨基水杨酸耐药机理研究 | 第31-105页 |
| 1 材料与方法 | 第31-65页 |
| ·试验材料 | 第31-39页 |
| ·菌株与质粒 | 第31-34页 |
| ·培养基 | 第34-35页 |
| ·试剂 | 第35-36页 |
| ·蛋白纯化缓冲液 | 第36-37页 |
| ·SDS/PAGE电泳用溶液及缓冲液 | 第37页 |
| ·结核分枝杆菌基因敲除所用的buffer和培养基 | 第37-38页 |
| ·结核分枝杆菌基因组提取试剂 | 第38页 |
| ·液相色谱使用的流动相 | 第38页 |
| ·实验仪器 | 第38-39页 |
| ·实验方法 | 第39-65页 |
| ·结核分枝杆菌自发突变耐药菌株筛选 | 第39页 |
| ·结核分枝杆菌对氨基水杨酸药物敏感性实验 | 第39页 |
| ·M. tuberculosis H37Ra自发突变耐药菌株全基因组测序 | 第39-40页 |
| ·结核分枝杆菌基因组的提取(CTAB法) | 第40页 |
| ·E. coli质粒的提取 | 第40-41页 |
| ·E. coli感受态细胞的制备(CaCl_2法) | 第41页 |
| ·E. coli感受态细胞的转化(CaCl_2法) | 第41页 |
| ·M. smegmatis mc~2155感受态细胞的制备 | 第41-42页 |
| ·M. bovis BCG,M. tubercuosis H37Ra和M. tubercuosis H37Rv感受态细胞的制备 | 第42页 |
| ·电击转化M. smegmatis mc~2155感受态细胞 | 第42页 |
| ·电击转化M. bovis BCG,M. tubercuosis H37Ra和M. tubercuosis H37Rv感受态细胞 | 第42-43页 |
| ·pET28a-folPl表达载体构建 | 第43-46页 |
| ·pMV261-folC,pMV361-folC和pMV361-mutfolC表达载体构建 | 第46-48页 |
| ·pMAL-c2X-folC和pMAL-c2X-folC表达载体构建 | 第48-50页 |
| ·M. tubercuosis H37Ra的folC基因的同源替换实验 | 第50-56页 |
| ·H_2Pte拮抗PAS的杀菌活性 | 第56-57页 |
| ·菌种的保存 | 第57页 |
| ·FolP1的诱导表达纯化及检测 | 第57-59页 |
| ·FolC的诱导表达与纯化 | 第59-61页 |
| ·FolP1底物H_2PtePP的合成 | 第61页 |
| ·合成并鉴定H_2Pte和H_2PtePAS | 第61-62页 |
| ·H_2Pte作为底物的野生型和突变体FolC酶活比较 | 第62-64页 |
| ·H_2PtePAS作为底物的野生型和突变体FolC酶活比较 | 第64页 |
| ·野生型FolC对两种底物催化速率的比较 | 第64-65页 |
| 2 实验结果与分析 | 第65-102页 |
| ·自发突变株耐药相关基因鉴定 | 第65-71页 |
| ·自发突变体的筛选与自发突变突变率 | 第65页 |
| ·野生型与耐药突变体基因组的提取 | 第65-66页 |
| ·全基因组测序与结果分析 | 第66-67页 |
| ·M. tuberculosis H37Ra和M. bovis BCG自发突变体耐药相关基因分析 | 第67-71页 |
| ·临床MDR菌株耐药相关基因鉴定 | 第71-73页 |
| ·野生型folC回补实验 | 第73-77页 |
| ·M. tuberculosis H37Ra基因组的提取 | 第73页 |
| ·从M. tuberculosis H37Ra基因组中扩增folC基因 | 第73-74页 |
| ·pMV261-folC表达载体的构建与酶切验证 | 第74页 |
| ·pMV261-folC表达载体转化到耐药菌株中 | 第74-75页 |
| ·回补试验对耐药菌株的药物敏感性的影响 | 第75-77页 |
| ·表达载体pMV361-folC,folCI43A和folC I43T转入H37Ra | 第77-79页 |
| ·folC,folCI43A和folCI43T基因的扩增 | 第77页 |
| ·pMV361-folC,folCI43A和folC I43T载体的构建与验证 | 第77-78页 |
| ·载体的转化与验证 | 第78-79页 |
| ·转入表达载体的菌株的基因组原始folC基因的敲除 | 第79-81页 |
| ·左右臂的扩增 | 第79页 |
| ·p0004S-L,R arm载体的构建与验证 | 第79-80页 |
| ·phAE159-p0004S-L, R arm 载体的构建与验证 | 第80页 |
| ·噬菌体的侵染与敲除的验证 | 第80-81页 |
| ·同源替换菌株药物敏感性测试 | 第81-82页 |
| ·H_2Pte拮抗PAS活性 | 第82-83页 |
| ·XTT法分析结果 | 第82页 |
| ·H_2Pte对PAS的药物敏感性的影响 | 第82-83页 |
| ·突变体FolC突变位点在酶结构中的分布 | 第83-84页 |
| ·不同来源的FolC序列分析 | 第84-86页 |
| ·野生型和突变体FolC蛋白的表达与纯化 | 第86-89页 |
| ·野生型和突变体基因组的提取 | 第86页 |
| ·野生型和突变体folC基因的扩增 | 第86页 |
| ·表达载体的构建与验证 | 第86-88页 |
| ·蛋白的表达与纯化 | 第88-89页 |
| ·H_2Pte为底物酶活比较 | 第89-93页 |
| ·HPLC分离标样 | 第89-90页 |
| ·标准曲线的制备 | 第90页 |
| ·酶活差异比较 | 第90-93页 |
| ·FolP1蛋白的表达与纯化 | 第93-94页 |
| ·folP1基因的扩增 | 第93页 |
| ·pET28a-folP1载体的构建与验证 | 第93页 |
| ·FolP蛋白的表达与纯化 | 第93-94页 |
| ·体外合成H_2Pte-PAS并用HPLC-MS/ESI分离验证反应产物 | 第94-96页 |
| ·H_2PtePAS为底物酶活比较 | 第96-99页 |
| ·野生型FolC催化两个底物H_2Pte和H_2PtePAS速率差异 | 第99-102页 |
| 3 讨论 | 第102-105页 |
| 第三章 结论 | 第105-106页 |
| 参考文献 | 第106-117页 |
| 发表及待发表文章目录 | 第117-118页 |
| 致谢 | 第118-119页 |
