| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 縮略词表 | 第12-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-23页 |
| 1 禽白血病病毒病原特性 | 第13-17页 |
| ·禽白血病病毒形态特征 | 第13-14页 |
| ·禽白血病病毒的理化性质 | 第14页 |
| ·禽白血病病毒的分类 | 第14-15页 |
| ·禽白血病病毒基因组结构 | 第15-16页 |
| ·P27蛋白 | 第16页 |
| ·禽白血病内、外源性病毒 | 第16-17页 |
| 2. 禽白血病病毒致病机理 | 第17-18页 |
| 3. 禽白血病病理学 | 第18-19页 |
| 4. 禽白血病流行病学 | 第19页 |
| 5. 禽白血病的检测方法及种群净化 | 第19-22页 |
| ·禽白血病病毒的分离与鉴定 | 第19-20页 |
| ·间接生物实验 | 第20页 |
| ·PCR和RT-PCR | 第20-21页 |
| ·ELISA | 第21页 |
| ·种群净化 | 第21-22页 |
| 6. 研究的目的和意义 | 第22-23页 |
| 第二章 禽白血病病毒P27蛋白间接ELISA检测方法的建立 | 第23-48页 |
| 1 试验材料 | 第23-27页 |
| ·毒株 | 第23页 |
| ·质粒和血清 | 第23页 |
| ·主要试剂 | 第23-24页 |
| ·主要仪器 | 第24页 |
| ·主要培养基和溶液的配置 | 第24-27页 |
| ·抗生素 | 第24-25页 |
| ·培养基类 | 第25页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳相关溶液 | 第25页 |
| ·Western blot相关溶液 | 第25页 |
| ·蛋白表达与检测的相关溶液 | 第25-26页 |
| ·纯化蛋白相关溶液的配置 | 第26页 |
| ·ELISA相关溶液 | 第26-27页 |
| 2 方法 | 第27-33页 |
| ·P27基因的克隆 | 第27-28页 |
| ·引物设计 | 第27页 |
| ·P27基因的扩增 | 第27页 |
| ·P27基因与克隆载体的连接 | 第27-28页 |
| ·重组质粒的转化 | 第28页 |
| ·对重组质粒进行鉴定 | 第28页 |
| ·重组表达质粒pET28a-P27的构建及其鉴定 | 第28-29页 |
| ·P27蛋白的诱导表达及蛋白的纯化 | 第29-30页 |
| ·重组质粒的转化 | 第29页 |
| ·P27蛋白诱导表达最佳条件的摸索 | 第29页 |
| ·P27蛋白表达形式的鉴定 | 第29-30页 |
| ·P27蛋白的纯化 | 第30页 |
| ·P27蛋白的鉴定 | 第30页 |
| ·间接ELISA检测方法的建立及其鉴定 | 第30-33页 |
| ·间接ELISA检测方法的操作步骤 | 第30-31页 |
| ·P27蛋白最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定 | 第31页 |
| ·P27蛋白最佳包被条件的确定 | 第31页 |
| ·最佳封闭剂和封闭时间的确定 | 第31页 |
| ·检测血清最佳作用时间的确定 | 第31-32页 |
| ·酶标二抗最佳稀释度和最佳作用时间的确定 | 第32页 |
| ·最佳显色时间的确定 | 第32页 |
| ·阴阳性临界值的确定 | 第32页 |
| ·特异性实验 | 第32页 |
| ·敏感性实验 | 第32-33页 |
| ·重复性实验 | 第33页 |
| ·符合性实验 | 第33页 |
| ·包被抗原保存期实验 | 第33页 |
| 3 结果 | 第33-44页 |
| ·P27基因PCR扩增结果 | 第33-34页 |
| ·pMD18-P27亚克隆重组质粒的鉴定 | 第34页 |
| ·pET28a-P27重组表达质粒的鉴定 | 第34-35页 |
| ·P27蛋白最佳诱导条件的摸索 | 第35-36页 |
| ·P27蛋白表达形式的鉴定 | 第36-37页 |
| ·P27蛋白的纯化及蛋白浓度 | 第37页 |
| ·P27蛋白的western blot结果 | 第37-38页 |
| ·禽白血病病毒P27蛋白间接ELISA检测方法的建立 | 第38-44页 |
| ·P27蛋白最佳包被浓度和血清稀释度的确定 | 第38-39页 |
| ·最佳包被条件的确定 | 第39页 |
| ·最佳封闭剂和封闭时间的确定 | 第39页 |
| ·被检血清最佳作用时间的确定 | 第39-40页 |
| ·酶标二抗最佳稀释度和作用时间的确定 | 第40页 |
| ·最佳显色时间的确定 | 第40-41页 |
| ·间接ELISA方法临界值的确定 | 第41页 |
| ·间接ELISA特异性 | 第41页 |
| ·间接ELISA敏感性 | 第41-42页 |
| ·间接ELISA重复性 | 第42-43页 |
| ·间接ELISA符合性 | 第43-44页 |
| ·间接ELISA包被抗原保存期时间的确定 | 第44页 |
| 4. 讨论 | 第44-47页 |
| ·关于重组表达质粒pET28a-P27 | 第44-45页 |
| ·关于P27蛋白的分析 | 第45页 |
| ·间接ELISA影响因素分析 | 第45-46页 |
| ·关于临界值的判定 | 第46页 |
| ·间接ELISA检测方法的评价 | 第46-47页 |
| 5. 结论 | 第47-48页 |
| 第三章 禽白血病病毒P27蛋白夹心ELISA检测方法的建立 | 第48-76页 |
| 1 试验材料 | 第48-50页 |
| ·试验动物 | 第48页 |
| ·蛋白与细胞 | 第48页 |
| ·主要试剂与材料 | 第48-49页 |
| ·主要仪器 | 第49页 |
| ·主要溶液的配制 | 第49-50页 |
| ·制备单克隆抗体相关溶液 | 第49页 |
| ·杂交瘤细胞染色体计数相关溶液 | 第49页 |
| ·纯化抗体相关溶液 | 第49-50页 |
| ·抗体检测相关溶液 | 第50页 |
| ·ELISA相关溶液 | 第50页 |
| 2 方法 | 第50-57页 |
| ·P27单克隆抗体的制备 | 第50-53页 |
| ·小鼠免疫 | 第50页 |
| ·细胞融合 | 第50页 |
| ·阳性杂交瘤的筛选和克隆 | 第50-51页 |
| ·单克隆抗体的生产和纯化 | 第51页 |
| ·单抗生物学特性鉴定 | 第51-53页 |
| ·P27蛋白多克隆抗体的制备 | 第53页 |
| ·日本大耳白兔的免疫 | 第53页 |
| ·多克隆抗体的纯化 | 第53页 |
| ·多克隆抗体的鉴定 | 第53页 |
| ·夹心ELISA检测方法的建立及其鉴定 | 第53-57页 |
| ·标准检测样品的选择 | 第53-54页 |
| ·夹心ELISA方法的操作程序 | 第54页 |
| ·捕获抗体的选择 | 第54页 |
| ·捕获抗体和检测抗体最佳浓度的确定 | 第54-55页 |
| ·酶标二抗最佳稀释度的确定 | 第55页 |
| ·最佳显色时间的确定 | 第55页 |
| ·标准阳性样品和标准阴性样品的确定 | 第55页 |
| ·最佳封闭剂和封闭时间的确定 | 第55页 |
| ·检测样品、多抗和酶标二抗最佳作用时间的确定 | 第55页 |
| ·阴阳性临界值的确定 | 第55-56页 |
| ·标准曲线的确定 | 第56页 |
| ·敏感性试验 | 第56页 |
| ·特异性试验 | 第56页 |
| ·重复性实验 | 第56页 |
| ·符合性实验 | 第56-57页 |
| 3. 结果 | 第57-72页 |
| ·抗禽白血病病毒P27蛋白单克隆抗体的制备 | 第57-61页 |
| ·免疫Balb/C小鼠血清效价的测定 | 第57页 |
| ·杂交瘤细胞的建立 | 第57页 |
| ·单抗的生物学性质鉴定 | 第57-61页 |
| ·抗禽白血病病毒P27蛋白多克隆抗体的制备 | 第61-63页 |
| ·免疫日本大耳白兔血清效价的测定 | 第61页 |
| ·纯化后兔多抗SDS-PAGE分析及蛋白浓度的测定 | 第61-62页 |
| ·兔多抗的western blot鉴定 | 第62-63页 |
| ·禽白血病病毒P27蛋白夹心ELISA检测方法的建立 | 第63-72页 |
| ·标准样品的选择 | 第63页 |
| ·捕获抗体的选择 | 第63页 |
| ·捕获抗体最佳包被浓度和检测抗体最佳稀释浓度的确定 | 第63-66页 |
| ·最佳酶标二抗稀释度的确定 | 第66页 |
| ·最佳显色时间的确定 | 第66-67页 |
| ·标准阳性对照和标准阴性对照的确定 | 第67页 |
| ·最佳封闭剂和封闭时间的确定 | 第67-68页 |
| ·最佳抗原、兔多抗和酶标二抗工作时间的确定 | 第68-69页 |
| ·夹心ELISA临界值的确定 | 第69页 |
| ·夹心ELISA标准曲线的确定 | 第69-70页 |
| ·夹心ELISA敏感性试验 | 第70页 |
| ·夹心ELISA特异性试验 | 第70-71页 |
| ·夹心ELISA重复性试验 | 第71页 |
| ·夹心ELISA符合性试验 | 第71-72页 |
| 4. 讨论 | 第72-75页 |
| ·单抗有关的影响因素 | 第72-73页 |
| ·多抗制备的影响因素 | 第73页 |
| ·夹心ELISA影响因素的分析 | 第73-74页 |
| ·夹心ELISA方法的评价 | 第74-75页 |
| 5. 结论 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-83页 |
| 致谢 | 第83页 |
