猪流行性乙型脑炎双抗体夹心ELISA检测试剂盒的研究
| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 縮略词表 | 第7-12页 |
| 1 前言 | 第12-18页 |
| ·流行性日本乙型脑炎病毒的研究进展 | 第12-14页 |
| ·日本乙型脑炎历史 | 第12页 |
| ·日本乙型脑炎流行病学 | 第12-13页 |
| ·日本乙型脑炎不同基因型分布情况 | 第13页 |
| ·日本乙型脑炎传播影响因素 | 第13-14页 |
| ·诊断技术进展 | 第14-18页 |
| ·分子技术诊断方法 | 第14-16页 |
| ·血清学诊断方法 | 第16页 |
| ·病毒分离技术 | 第16-17页 |
| ·展望 | 第17-18页 |
| 2 材料及方法 | 第18-30页 |
| ·材料 | 第18-19页 |
| ·单抗、毒株与细胞系 | 第18页 |
| ·实验动物 | 第18页 |
| ·主要试剂及配制 | 第18页 |
| ·主要仪器设备 | 第18-19页 |
| ·方法 | 第19-30页 |
| ·JEV单克隆抗体的制备及纯化 | 第19-21页 |
| ·杂交瘤细胞的复苏 | 第19页 |
| ·杂交瘤细胞的培养及传代 | 第19页 |
| ·杂交瘤细胞的冻存 | 第19页 |
| ·小鼠的预处理 | 第19页 |
| ·接种杂交瘤细胞 | 第19-20页 |
| ·腹水收集 | 第20页 |
| ·腹水的处理与保存 | 第20页 |
| ·采用辛酸—硫酸铵法提纯腹水 | 第20-21页 |
| ·腹水的亲和层析纯化 | 第21页 |
| ·单克隆抗体的检验 | 第21页 |
| ·兔抗高免血清的制备纯化及检验 | 第21-24页 |
| ·细胞培养 | 第21-22页 |
| ·病毒增殖 | 第22页 |
| ·病毒的浓缩-PEG法 | 第22页 |
| ·JEV的纯化 | 第22页 |
| ·家兔的免疫 | 第22-23页 |
| ·兔血清抗体水平的检测 | 第23页 |
| ·兔抗JEV高免血清的收集及保存 | 第23页 |
| ·采用辛酸—硫酸铵法提纯血清 | 第23-24页 |
| ·血清的纯化 | 第24页 |
| ·兔高免血清抗体的检验 | 第24页 |
| ·双抗体ELISA方法的建立 | 第24-26页 |
| ·双抗夹心ELISA基本操作步骤 | 第24-25页 |
| ·酶标抗体工作浓度的确定 | 第25页 |
| ·抗原与单克隆抗体最佳结合浓度的确定 | 第25页 |
| ·兔抗JEV高免血清与单抗最佳结合浓度的选择 | 第25-26页 |
| ·封闭液及封闭时间的选择 | 第26页 |
| ·酶标抗体作用时间的选择 | 第26页 |
| ·底物显色时间的选择 | 第26页 |
| ·阴阳性判定标准的确定 | 第26页 |
| ·双抗体夹心ELISA方法敏感性试验及其对比试验 | 第26-28页 |
| ·ELISA方法的敏感性试验 | 第26-27页 |
| ·应用试剂盒提取病毒RNA | 第27页 |
| ·反转录合成cDNA | 第27页 |
| ·PCR反应及产物分析 | 第27-28页 |
| ·特异性试验 | 第28页 |
| ·试剂盒的组装及稳定性试验 | 第28-29页 |
| ·试剂盒的组装 | 第28页 |
| ·组内重复试验 | 第28页 |
| ·组间重复试验 | 第28页 |
| ·保存期试验 | 第28-29页 |
| ·试剂盒的初步应用 | 第29-30页 |
| 3 试验结果 | 第30-42页 |
| ·单克隆抗体的制备及纯化 | 第30-32页 |
| ·杂交瘤细胞的复苏及传代培养 | 第30页 |
| ·腹水的制备 | 第30-31页 |
| ·收集腹水琼扩效价测定 | 第31页 |
| ·小鼠单克隆抗体腹水的纯化后SDS-PAGE鉴定 | 第31-32页 |
| ·兔抗JEV高免血清的制备 | 第32-34页 |
| ·BHk21感染JEV后细胞倒置显微镜下进行观察 | 第32-33页 |
| ·收集兔抗JEV高免血清琼扩效价测定 | 第33页 |
| ·兔抗JEV高免血清的纯化后SDS-PAGE鉴定 | 第33-34页 |
| ·ELISA方法的建立 | 第34-38页 |
| ·酶标抗体工作浓度的确定 | 第34-35页 |
| ·抗原与单抗最佳结合浓度的确定 | 第35页 |
| ·兔高免血清和单克隆抗体稀释度的确定 | 第35-36页 |
| ·封闭及封闭时间的确定 | 第36-37页 |
| ·酶标抗体作用时间 | 第37页 |
| ·底物显色时间的选择 | 第37-38页 |
| ·阴阳性判断标准的确定 | 第38页 |
| ·双抗体夹心ELISA方法敏感性测定 | 第38-40页 |
| ·双抗体夹心ELISA方法敏感性 | 第38-39页 |
| ·JEV特异性引物RT-PCR扩增结果 | 第39-40页 |
| ·特异性检测 | 第40页 |
| ·试剂盒稳定性试验 | 第40-41页 |
| ·组内重复试验 | 第40页 |
| ·组间重复性试验 | 第40-41页 |
| ·试剂盒的保存期试验 | 第41页 |
| ·试剂盒的初步应用 | 第41-42页 |
| 4 讨论 | 第42-45页 |
| ·免高免血清的制备 | 第42页 |
| ·单克隆抗体的制备 | 第42-43页 |
| ·高免血清和单克隆抗体的纯化 | 第43页 |
| ·双抗夹心ELISA的条件优化 | 第43-45页 |
| 5 结论 | 第45-46页 |
| 参考文献 | 第46-50页 |
| 致谢 | 第50-51页 |
| 附录一：主要试剂的配制 | 第51-52页 |
