| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-20页 |
| 1、α-1,3半乳糖转移酶(GGTA1)基因研究进展 | 第13-15页 |
| ·GGTA1基因定位 | 第13页 |
| ·GGTA1的结构与功能 | 第13-14页 |
| ·GGTA1与异种移植 | 第14-15页 |
| ·存在的问题与发展前景 | 第15页 |
| 2、RNAi研究进展 | 第15-20页 |
| ·RNAi发现 | 第16页 |
| ·RNAi的作用机制 | 第16-18页 |
| ·RNAi在哺乳动物中的应用 | 第18页 |
| ·RNAi的应用前景 | 第18-20页 |
| 第二章 实验研究 | 第20-70页 |
| 试验一 广西巴马小型猪α-1,3半乳糖转移酶基因真核表达载体的构建及鉴定 | 第20-41页 |
| 1、材料 | 第20-22页 |
| ·实验动物 | 第20页 |
| ·菌株及克隆载体 | 第20页 |
| ·主要试剂 | 第20页 |
| ·普通试剂及来源 | 第20-21页 |
| ·主要仪器 | 第21页 |
| ·溶液与培养基的配制 | 第21-22页 |
| 2、实验方法 | 第22-31页 |
| ·引物设计与合成 | 第22页 |
| ·总RNA的提取 | 第22页 |
| ·RT-PCR扩增 | 第22-24页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第24页 |
| ·连接pMD18-T克隆载体 | 第24-25页 |
| ·pMD18-GGTA1重组质粒转化 | 第25页 |
| ·重组质粒pMD18-GGTA1的鉴定 | 第25-26页 |
| ·pDsRed1-GGTA1-1与pDsRed1-GGTA1-2载体的构建 | 第26-28页 |
| ·重组质粒pDsRed1-GGTA1-1、pDsRed1-GGTA1-2在PK-15细胞中的表达 | 第28-31页 |
| 3、实验结果 | 第31-36页 |
| ·广西巴马小型猪总RNA的提取 | 第31页 |
| ·广西巴马小型猪GTTA1的RT-PCR扩增 | 第31页 |
| ·广西巴马小型猪pMD18-GTTA1的菌液PCR鉴定 | 第31-32页 |
| ·缺失第五外显子pMD18-GGTA1-1、未缺失第五外显子pMD18-GGTA1-2与pDsRed1-N_1双酶切 | 第32页 |
| ·重组质粒pDsRedl-GGTA1-1(缺失第五外显子)和pDsRedl-GGTA1-2(未缺失第五外显子)菌液PCR鉴定 | 第32-33页 |
| ·重组质粒pDsRed1-GGTA1-1和pDsRed1-GGTA1-2的双酶切鉴定 | 第33-34页 |
| ·载体转染细胞的显微观察 | 第34-36页 |
| 4、讨论 | 第36-40页 |
| ·序列分析 | 第36-39页 |
| ·真核载体脂质体转染水平检测 | 第39-40页 |
| 5、结论 | 第40-41页 |
| 试验二 广西巴马小型猪α-1,3半乳糖转移酶基因RNAi载体的构建及其沉默效率的检测 | 第41-70页 |
| 1、材料 | 第41-43页 |
| ·质粒、菌株与细胞 | 第41页 |
| ·酶与试剂 | 第41-42页 |
| ·主要仪器 | 第42页 |
| ·主要溶液配制 | 第42-43页 |
| ·Western Blot主要试剂配制 | 第43页 |
| 2、方法 | 第43-55页 |
| ·引物设计 | 第43-44页 |
| ·RNAi载体构建 | 第44-46页 |
| ·菌液PCR筛选阳性重组子 | 第46-48页 |
| ·干扰载体pLLU2G-shGGTA1-1、pLLU2G-shGGTA1-2、pLLU2G-shGGTA1-3、pLLU2G-shGGTA1-Control脂质体转染PK-15细胞 | 第48-49页 |
| ·干扰载体沉默效率的检测 | 第49-51页 |
| ·Western blot检测GGTA1蛋白水平的干扰效果 | 第51-55页 |
| 3、结果 | 第55-66页 |
| ·pLLU2G-shGGTA1-1菌液PCR鉴定 | 第55页 |
| ·pLLU2G-shGGTA1-2菌液PCR鉴定 | 第55页 |
| ·pLLU2G-shGGTA1-3菌液PCR鉴定 | 第55-56页 |
| ·干扰质粒转染PK-15细胞 | 第56-59页 |
| ·细胞总RNA的提取 | 第59-60页 |
| ·GGTA1基因与β-actin基因标准曲线的建立以及干扰载体沉默效率的检测 | 第60-65页 |
| ·蛋白水平沉默GGTA1基因效率的检测 | 第65-66页 |
| 4、讨论 | 第66-69页 |
| ·应用实时荧光定量PCR方法检测干扰质粒沉默GGTA1基因表达的效果 | 第66-67页 |
| ·Western blot检测干扰质粒沉默GGTA1基因表达的效果 | 第67-69页 |
| 5、结论 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-75页 |
| 致谢 | 第75-76页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第76页 |
