| 目录 | 第1-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-11页 |
| 前言 | 第11-24页 |
| 1 巨噬细胞参与机体慢性炎症疾病的生理病理过程 | 第11-14页 |
| ·巨噬细胞的分化、激活和功能 | 第11-13页 |
| ·巨噬细胞参与疾病过程 | 第13-14页 |
| 2 Sirt1的功能提示它可能具有抗炎作用 | 第14-18页 |
| ·组蛋白乙酰转移酶与组蛋白去乙酰化酶的协调作用影响基因表达调控 | 第14-15页 |
| ·Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶Sirt1调节多种靶蛋白发挥功能 | 第15-17页 |
| ·增加内源Sirt1可能介导了能量限制的抗炎抗氧化作用 | 第17-18页 |
| 3 AP-1在哺乳动物细胞中普遍存在是一种促炎转录因子 | 第18-22页 |
| ·AP-1在多种细胞中普遍存在功能广泛 | 第18-19页 |
| ·AP-1的转录活性受到多个水平的调节 | 第19-20页 |
| ·AP-1通过下游靶基因发挥生物学作用 | 第20-21页 |
| ·COX-2在巨噬细胞中的作用 | 第21-22页 |
| 4 Sirt1通过与AP-1的直接相互作用抑制其活性并影响下游基因表达是本研究的重点 | 第22-24页 |
| 实验材料 | 第24-26页 |
| 1. 菌株与质粒 | 第24页 |
| 2. 限制性内切酶和其他修饰酶 | 第24页 |
| 3. 细胞系 | 第24页 |
| 4. 实验用小鼠及饲料 | 第24-25页 |
| 5. 其它主要试剂和材料 | 第25页 |
| 6. 实验用抗体 | 第25页 |
| 7. 主要仪器设备 | 第25-26页 |
| 实验方法 | 第26-50页 |
| 1. 细菌操作与质粒的转化 | 第26-27页 |
| ·感受态大肠杆菌DH5-α制备 | 第26页 |
| ·质粒的转化和扩增 | 第26页 |
| ·质粒的提取和纯化 | 第26-27页 |
| 2. 克隆构建 | 第27-29页 |
| ·c-Fos,c-Jun表达质粒构建 | 第27-28页 |
| ·c-Fos,c-Jun片段缺失突变质粒构建 | 第28-29页 |
| ·COX-2启动子点突变 | 第29页 |
| 3. 细胞培养 | 第29-31页 |
| ·细胞的生长条件 | 第29-30页 |
| ·细胞的传代 | 第30页 |
| ·细胞的复苏及冻存 | 第30-31页 |
| 4. 双荧光素酶报告系统测定启动子活性 | 第31页 |
| 5. 半定量RT-PCR | 第31-32页 |
| ·RNA提取 | 第31页 |
| ·逆转录PCR(RT-PCR) | 第31-32页 |
| 6. Western Blotting | 第32-35页 |
| ·细胞及组织总蛋白提取 | 第32页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第32-33页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第33-34页 |
| ·抗原抗体反应 | 第34页 |
| ·辣根过氧化物酶化学发光法检测蛋白(ECL反应) | 第34页 |
| ·溶液配制 | 第34-35页 |
| 7. 蛋白质免疫共沉淀 | 第35-36页 |
| ·细胞裂解 | 第35页 |
| ·免疫共沉淀 | 第35-36页 |
| ·SDS-PAGE | 第36页 |
| 8. EMSA | 第36-39页 |
| ·核蛋白提取 | 第36页 |
| ·生物素标记探针 | 第36-37页 |
| ·PAGE电泳转膜 | 第37-38页 |
| ·杂交及显影 | 第38页 |
| ·溶液配制 | 第38-39页 |
| 9. 原代小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养 | 第39-40页 |
| ·腹腔巨噬细胞的分离培养 | 第39页 |
| ·巨噬细胞Wright-Giemsa染色 | 第39-40页 |
| 10. 能量限制动物模型制备 | 第40页 |
| 11. 腺病毒的构建,包装及巨噬细胞腺病毒感染 | 第40-43页 |
| ·腺病毒构建 | 第40-42页 |
| ·腺病毒包装 | 第42页 |
| ·腺病毒感染巨噬细胞 | 第42-43页 |
| 12. 巨噬细胞功能检测 | 第43-45页 |
| ·巨噬细胞吞噬实验 | 第43页 |
| ·巨噬细胞肿瘤杀伤实验 | 第43-44页 |
| ·溶液配制 | 第44-45页 |
| 13 细胞上清NO及PGE_2测定 | 第45页 |
| ·NO测定 | 第45页 |
| ·PGE_2测定 | 第45页 |
| 14. 染色质免疫共沉淀(ChIP) | 第45-49页 |
| ·细胞固定 | 第45-46页 |
| ·细胞核的提取 | 第46页 |
| ·细胞核的裂解与超声处理 | 第46页 |
| ·超声结果的分析 | 第46页 |
| ·免疫共沉淀 | 第46-47页 |
| ·DNA的分离及纯化 | 第47页 |
| ·PCR反应 | 第47页 |
| ·溶液配制 | 第47-49页 |
| 15. 统计学分析 | 第49-50页 |
| 实验结果 | 第50-78页 |
| 1. Sirt1抑制AP-1的报告基因活性 | 第50-54页 |
| 2. Sirt1与c-Fos,c-Jun相互作用 | 第54-59页 |
| 3. Sirt1抑制p300诱导的c-Fos,c-Jun的乙酰化水平升高 | 第59-61页 |
| 4. Sirt1抑制AP-1的DNA结合能力 | 第61-62页 |
| 5. 腺病毒载体构建并在巨噬细胞内表达 | 第62-63页 |
| 6. Sirt1抑制AP-1下游靶基因COX-2的表达 | 第63-67页 |
| 7. Sirt1下调巨噬细胞上清炎症标志分子NO及PGE_2 | 第67-68页 |
| 8. Sirt1改善巨噬细胞吞噬功能及肿瘤杀伤功能 | 第68-69页 |
| 9. 能量限制小鼠模拟巨噬细胞高表达Sirt1 | 第69-75页 |
| 10. PMA诱导巨噬细胞Sirt1表达上调 | 第75-78页 |
| 讨论 | 第78-88页 |
| 1. 能量限制对机体的保护作用可能通过体内Sirt1高表达来实现 | 第78-80页 |
| 2. Sirt1对AP-1的调节可能是通过降低AP-1乙酰化程度和抑制AP-1的DNA结合能力两种机制来实现 | 第80-82页 |
| ·AP-1的调节受到多个水平的影响 | 第80页 |
| ·Sirt1发挥功能通常是通过对下游靶基因的去乙酰化来实现 | 第80-81页 |
| ·Sirt1通过降低AP-1乙酰化程度和抑制AP-1的DNA结合能力两种机制下调AP-1活性 | 第81页 |
| ·负显性突变的Sirt1对AP-1的功能与野生型Sirt1类似 | 第81-82页 |
| 3. 在巨噬细胞中Sirt1抑制AP-1下游靶基因COX-2的表达及活性 | 第82-84页 |
| ·选择巨噬细胞作为研究对象的优势 | 第82-83页 |
| ·COX-2可以被AP-1等多种转录因子激活表达 | 第83页 |
| ·COX-2合成PGE_2并参与炎症及巨噬细胞功能调节 | 第83-84页 |
| 4. 本文应用Sir2的激活剂与抑制剂进一步证明Sirt1的作用 | 第84-85页 |
| 5. PMA诱导Sirt1的表达上调是一种体现了炎症自限性的负反馈保护机制 | 第85-86页 |
| 6. 本研究的不足与进一步实验方向 | 第86-88页 |
| 小结 | 第88-89页 |
| 参考文献 | 第89-95页 |
| 文献综述 | 第95-111页 |
| 英文名词及缩写 | 第111-113页 |
| 致谢 | 第113-114页 |
| 个人简历 | 第114-116页 |
