| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-47页 |
| 1 草坪草遗传转化研究进展 | 第17-21页 |
| ·草坪草离体培养再生体系的建立 | 第17-19页 |
| ·草坪草遗传转化研究进展 | 第19-21页 |
| 2 植物抗旱相关基因及其应用 | 第21-33页 |
| ·植物中的抗旱相关的功能基因及其应用 | 第22-30页 |
| ·渗透调节物质合成及调节相关基因及其应用 | 第22-27页 |
| ·与脯氨酸(Proline)合成有关的酶基因 | 第22-23页 |
| ·与甜菜碱合成有关的酶基因 | 第23页 |
| ·与甘氨酰甜菜碱(Glycine betaine)合成有关的基因 | 第23-24页 |
| ·与海藻糖(Trehalose)合成有关的酶基因 | 第24-25页 |
| ·与果聚糖(Fructant)合成相关的酶基因 | 第25页 |
| ·糖醇合成的相关基因 | 第25-26页 |
| ·肌醇甲酯(D-ononitol)生物合成相关基因 | 第26页 |
| ·多胺(Polyamine)合成相关基因 | 第26-27页 |
| ·调控水通道蛋白基因 | 第27页 |
| ·活性氧清除相关基因及其应用 | 第27-29页 |
| ·SOD基因 | 第27-28页 |
| ·CAT基因 | 第28页 |
| ·POD基因 | 第28-29页 |
| ·保护生物大分子及膜结构的蛋白基因及其应用 | 第29-30页 |
| ·胚胎发生后期富集蛋白基因(Lea)及Lea相关基因 | 第29-30页 |
| ·调渗蛋白基因 | 第30页 |
| ·脱水蛋白基因 | 第30页 |
| ·植物中的抗旱相关的调节基因及其应用 | 第30-32页 |
| ·与信号传导相关的基因 | 第30-31页 |
| ·编码转录因子的调节基因 | 第31-32页 |
| ·展望 | 第32-33页 |
| 3 草坪草对干旱胁迫的反应 | 第33-40页 |
| ·草坪草避旱性 | 第34-36页 |
| ·根系形态和根系活力 | 第34-35页 |
| ·气孔开闭与水分蒸腾 | 第35-36页 |
| ·草坪草耐旱性 | 第36-40页 |
| ·叶片的适应性 | 第36页 |
| ·细胞壁的变化 | 第36-37页 |
| ·膜透性的变化 | 第37-38页 |
| ·渗透调节 | 第38页 |
| ·脯氨酸含量的变化 | 第38-39页 |
| ·抗氧化酶活性的变化 | 第39-40页 |
| 4 本论文研究目的和意义 | 第40-44页 |
| 5 本研究的技术路线 | 第44-47页 |
| 第二章 多年生黑麦草高频再生体系的建立及优化 | 第47-55页 |
| 1 材料与方法 | 第47-48页 |
| ·材料 | 第47页 |
| ·方法 | 第47-48页 |
| ·外植体 | 第47页 |
| ·外植体的消毒预处理 | 第47-48页 |
| ·培养基及培养条件 | 第48页 |
| ·数据处理 | 第48页 |
| 2 结果与分析 | 第48-52页 |
| ·不同外植体处理方式对愈伤组织诱导的影响 | 第48-49页 |
| ·2.4-D浓度对不同品种愈伤组织诱导率的影响 | 第49页 |
| ·外植体在不同基本培养基上诱导愈伤组织的情况 | 第49-51页 |
| ·不同基本培养基对愈伤组织分化不定芽的影响 | 第51-52页 |
| ·生根和移栽 | 第52页 |
| 3 讨论 | 第52-55页 |
| ·外植体的选择及预处理 | 第52-53页 |
| ·培养基成分对愈伤组织诱导的影响 | 第53页 |
| ·愈伤组织分化不定芽 | 第53-55页 |
| 第三章 Bar+nas双价基因转化多年生黑麦草 | 第55-90页 |
| 1 试验材料 | 第56-57页 |
| ·黑麦草品种 | 第56页 |
| ·菌株、质粒与基因 | 第56页 |
| ·试剂 | 第56-57页 |
| 2 试验方法 | 第57-71页 |
| ·p3301-gus-nas植物表达载体的构建 | 第57-65页 |
| ·pCAMBIA 3301-gus的构建 | 第57-60页 |
| ·pCAMBIA 3301和pBI121质粒提取 | 第57页 |
| ·用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ分别双酶切pCAMBIA 3301和pBI121 | 第57-58页 |
| ·酶切片段回收 | 第58页 |
| ·回收片段连接 | 第58页 |
| ·重组质粒转化DH5α | 第58-59页 |
| ·重组质粒检测 | 第59-60页 |
| ·p3301-gus-nas载体的构建 | 第60-63页 |
| ·p3301-gus和p0390-MF-nashor1质粒提取 | 第60页 |
| ·BamH Ⅰ酶切p0390-MF-nashor1和pCAMBIA 3301-gus | 第60页 |
| ·酶切片段的回收 | 第60页 |
| ·pCAMBIA 3301-gus酶切回收产物去磷酸化 | 第60-61页 |
| ·去磷酸化片段的回收 | 第61页 |
| ·目的基因nas与表达载体pCAMBIA 3301-gus的连接 | 第61页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第61页 |
| ·连接产物转化DH5α | 第61-62页 |
| ·拟转化子的鉴定 | 第62-63页 |
| ·p3301-gus-nas转化农杆菌 | 第63-65页 |
| ·p3301-gus-nas质粒的提取 | 第63页 |
| ·农杆菌感受态细胞的制备 | 第63页 |
| ·p3301-gus-nas转化农杆菌 | 第63-64页 |
| ·检测 | 第64-65页 |
| ·Nas基因原核表达及多克隆抗体制备 | 第65-66页 |
| ·引物设计 | 第65页 |
| ·NAS蛋白编码基因的扩增 | 第65页 |
| ·重组表达载体的构建及其鉴定 | 第65-66页 |
| ·重组蛋白GST-NAS的诱导表达 | 第66页 |
| ·GST-NAS蛋白包涵体的纯化与抗体制备 | 第66页 |
| ·Western blotting检测 | 第66页 |
| ·其他方法 | 第66页 |
| ·外植体培养 | 第66-67页 |
| ·培养基 | 第66-67页 |
| ·培养方法 | 第67页 |
| ·农杆菌转化 | 第67-68页 |
| ·农杆菌转化用培养基 | 第67页 |
| ·农杆菌对愈伤组织的转化 | 第67-68页 |
| ·转化子的筛选 | 第68页 |
| ·筛选剂抑制效果的测定 | 第68页 |
| ·转化子的筛选与再生培养 | 第68页 |
| ·转化植株的分子检测 | 第68-71页 |
| ·植物总DNA的提取 | 第68-69页 |
| ·试剂配制 | 第68页 |
| ·植物总DNA的微量提取(用于PCR) | 第68-69页 |
| ·转化植株的PCR分析 | 第69-70页 |
| ·Bar基因的PCR分析 | 第69页 |
| ·Nas基因的PCR分析 | 第69页 |
| ·RT-PCR检测 | 第69-70页 |
| ·蛋白质的免疫检测(Western blot) | 第70-71页 |
| ·植物总可溶性蛋白的提取 | 第70页 |
| ·蛋白质的电转移 | 第70-71页 |
| ·封闭、杂交及显色 | 第71页 |
| 3 结果与分析 | 第71-81页 |
| ·p3301-gus-nas植物表达载体的构建 | 第71-73页 |
| ·pCAMBIA 3301-gus的构建 | 第71-72页 |
| ·p3301-gus-nas载体的构建 | 第72-73页 |
| ·p3301-gus-nas转化根癌农杆菌 | 第73页 |
| ·Nas基因原核表达和多克隆抗体制备 | 第73-76页 |
| ·NAS蛋白编码基因亚克隆 | 第73页 |
| ·原核重组表达质粒pKG-NAS的鉴定 | 第73-74页 |
| ·NAS蛋白的原核表达 | 第74-76页 |
| ·NAS多克隆抗体的制备及效价检测 | 第76页 |
| ·愈伤组织筛选条件的确定 | 第76-77页 |
| ·转化方法的改进 | 第77-79页 |
| ·共培养方式的改进 | 第77页 |
| ·多年生黑麦草农杆菌转化体系的建立 | 第77-79页 |
| ·转化植株的获得 | 第79页 |
| ·拟转化株的检测 | 第79-81页 |
| ·PCR检测结果 | 第79-80页 |
| ·Bar基因的PCR分析 | 第80页 |
| ·Nas基因的PCR分析 | 第80页 |
| ·Nas基因在转基因植株中的转录和表达 | 第80-81页 |
| 4 讨论 | 第81-90页 |
| ·影响农杆菌转化多年生黑麦草的主要因素 | 第81-86页 |
| ·受体系统的再生能力 | 第82页 |
| ·受体细胞的状态 | 第82-84页 |
| ·农杆菌菌株的选择和表达载体的构建 | 第84页 |
| ·Vir基因活化物的添加 | 第84-85页 |
| ·合适的筛选方式 | 第85-86页 |
| ·转基因多年生黑麦草的生物安全性问题 | 第86-90页 |
| 第四章 转基因植株抗性鉴定 | 第90-114页 |
| 1 材料与方法 | 第90-97页 |
| ·供试材料 | 第90页 |
| ·方法 | 第90-97页 |
| ·转基因植株除草剂抗性检测 | 第90页 |
| ·转基因植株抗旱性检测 | 第90-97页 |
| ·干旱处理 | 第90-91页 |
| ·土壤含水量测定 | 第91页 |
| ·叶片相对含水量(RWC)测定 | 第91页 |
| ·叶绿素含量的测定 | 第91-92页 |
| ·脯氨酸含量的测定 | 第92-93页 |
| ·丙二醛(MDA)含量测定 | 第93-94页 |
| ·超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定 | 第94-95页 |
| ·过氧化物酶(POD)活性测定 | 第95-96页 |
| ·过氧化氢酶(CAT)活性测定 | 第96页 |
| ·植物细胞膜通透性的测定 | 第96-97页 |
| 2 结果与分析 | 第97-105页 |
| ·除草剂抗性鉴定 | 第97-98页 |
| ·转化株与对照株整体抗旱性评价 | 第98-99页 |
| ·干旱处理过程中土壤含水量的变化 | 第99页 |
| ·植株高度和根系生长状况 | 第99页 |
| ·转化株与对照株叶片相对含水量变化 | 第99-101页 |
| ·转化株与对照株叶绿素含量变化 | 第101页 |
| ·转化株与对照株叶片丙二醛含量变化 | 第101-102页 |
| ·转化株与对照株叶片脯氨酸含量变化 | 第102-103页 |
| ·转化株与对照株SOD、POD、CAT活性变化 | 第103-104页 |
| ·转化株与对照株质膜透性变化 | 第104-105页 |
| 3 讨论 | 第105-114页 |
| ·草坪草抗旱性的研究方法 | 第105-107页 |
| ·多年生黑麦草生理生化指标的变化与抗旱性的关系 | 第107-112页 |
| ·我国草坪草抗旱研究存在的问题与发展方向 | 第112-114页 |
| 本研究的总结及创新点 | 第114-116页 |
| I 总结 | 第114-115页 |
| II 本研究的创新点 | 第115-116页 |
| 参考文献 | 第116-143页 |
| 附录A:质粒结构图 | 第143-145页 |
| 致谢 | 第145-148页 |
| 作者简介 | 第148-149页 |
| 在读期间科研学术成果目录 | 第149页 |
