| 摘要 | 第1-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 略缩词 | 第11-12页 |
| 第1章 文献综述 | 第12-23页 |
| ·结核病的历史及流行现状 | 第12-15页 |
| ·病原 | 第13页 |
| ·发病症状 | 第13-14页 |
| ·流行现状 | 第14-15页 |
| ·结核病的诊断方法 | 第15-17页 |
| ·病理检测方法 | 第15-16页 |
| ·细菌学检验方法 | 第16页 |
| ·PCR | 第16页 |
| ·免疫学方法 | 第16-17页 |
| ·其它方法 | 第17页 |
| ·抗原特异性IFN-γ试验 | 第17-22页 |
| ·试验原理 | 第17页 |
| ·抗原特异性IFN-γ试验的应用 | 第17-20页 |
| ·新型TB特异性抗原在抗原特异性IFN-γ试验中的应用 | 第20页 |
| ·抗原特异性IFN-γ试验在牛TB诊断中的应用 | 第20-22页 |
| ·展望 | 第22-23页 |
| 第2章 牛IFN-γ基因的克隆及表达 | 第23-34页 |
| ·研究目的和意义 | 第23页 |
| ·材料与方法 | 第23-31页 |
| ·材料 | 第23-26页 |
| ·质粒及菌株 | 第23页 |
| ·主要药品及试剂 | 第23-24页 |
| ·细菌培养基的配制 | 第24页 |
| ·质粒抽提与鉴定试剂的配制 | 第24-25页 |
| ·SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液的配制 | 第25页 |
| ·SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液的配制 | 第25-26页 |
| ·其它试剂的配制 | 第26页 |
| ·方法 | 第26-31页 |
| ·引物设计及合成: | 第26-27页 |
| ·淋巴细胞的分离培养、诱导及总RNA的提取 | 第27页 |
| ·RT- PCR扩增cDNA合成 | 第27页 |
| ·PCR产物的回收与纯化 | 第27页 |
| ·重组表达质粒pETBovIFN-γ的构建 | 第27-28页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) | 第28页 |
| ·连接产物及质粒的转化 | 第28页 |
| ·质粒的提取 | 第28-29页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第29页 |
| ·诱导表达 | 第29页 |
| ·表达蛋白的纯化 | 第29-30页 |
| ·包涵体提取 | 第30页 |
| ·不可溶性表达产物(包涵体)的溶解和复性 | 第30页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第30-31页 |
| ·结果与分析 | 第31-32页 |
| ·BovIFN-γ的克隆 | 第31页 |
| ·pETBovIFN-γ表达载体的构建与测序 | 第31-32页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE分析 | 第32页 |
| ·讨论 | 第32-33页 |
| ·小结 | 第33-34页 |
| 第3章 抗BovIFN-γ单克隆抗体的制备 | 第34-47页 |
| ·研究目的意义 | 第34页 |
| ·材料与方法 | 第34-40页 |
| ·材料 | 第34-35页 |
| ·细胞、菌株、载体、动物 | 第34页 |
| ·培养基及主要试剂 | 第34页 |
| ·培养基及主要试剂的配制 | 第34-35页 |
| ·Western blot缓冲液的配制 | 第35页 |
| ·方法 | 第35-40页 |
| ·单克隆抗体制备的技术路线 | 第35页 |
| ·抗原的制备 | 第35页 |
| ·动物免疫 | 第35-36页 |
| ·SP2/O骨髓瘤细胞的活化 | 第36页 |
| ·SP2/O骨髓瘤细胞的制备 | 第36页 |
| ·免疫脾细胞的制备 | 第36-37页 |
| ·饲养细胞的制备 | 第37页 |
| ·细胞融合 | 第37页 |
| ·间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清 | 第37-38页 |
| ·杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法) | 第38页 |
| ·杂交瘤细胞染色体数的检测 | 第38页 |
| ·单克隆抗体的生产和效价测定 | 第38-39页 |
| ·单克隆抗体亚类鉴定 | 第39页 |
| ·单克隆抗体的结合活性及特异性鉴定 | 第39页 |
| 3 .2.2.15 Western blot | 第39-40页 |
| ·结果与分析 | 第40-43页 |
| ·抗原的制备 | 第40页 |
| ·细胞融合 | 第40页 |
| ·杂交瘤细胞的筛选 | 第40-41页 |
| ·单克隆抗体的生产和效价测定 | 第41页 |
| ·杂交瘤细胞染色体数的检测 | 第41页 |
| ·单克隆抗体亚类鉴定 | 第41-42页 |
| ·IFN-γ单克隆抗体的结合活性与特异性 | 第42页 |
| ·IFN-γ单克隆抗体的特异性 | 第42-43页 |
| ·讨论 | 第43-46页 |
| ·小结 | 第46-47页 |
| 第4章 牛IFN-γ的双抗体夹心间接ELISA方法建立 | 第47-51页 |
| ·研究目的和意义 | 第47页 |
| ·材料与方法 | 第47-48页 |
| ·材料 | 第47页 |
| ·主要试剂及材料 | 第47页 |
| ·ELISA及IHA缓冲液的配制 | 第47页 |
| ·方法 | 第47-48页 |
| ·最佳抗体包被量和夹心抗体稀释度的选择 | 第47-48页 |
| ·牛IFN-γ的双抗体夹心间接ELISA方法建立 | 第48页 |
| ·结果与分析 | 第48-49页 |
| ·最佳抗体包被量和抗原稀释度的选择 | 第48页 |
| ·牛IFN-γ双抗体夹心ELISA鉴别方法研制结果 | 第48-49页 |
| ·结合活性及特异性试验结果 | 第49页 |
| ·讨论 | 第49-50页 |
| ·小结 | 第50-51页 |
| 第5章 总结 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-57页 |
| 致谢 | 第57-58页 |
| 附录 | 第58页 |
