| 中文摘要 | 第1-6页 |
| 英文摘要 | 第6-8页 |
| 目录 | 第8-11页 |
| 第一章 重组hIL-12病毒在Sf9细胞传代中遗传稳定性研究 | 第11-29页 |
| 前言 | 第11-18页 |
| 1 人白介素-12的研究概况 | 第11-12页 |
| 2 杆状病毒表达载体系统研究概况 | 第12-15页 |
| 3 重组病毒Ac-hIL12的构建原理 | 第15-16页 |
| 4 杆状病毒的传代效应 | 第16-17页 |
| 5 本研究的目的和意义 | 第17-18页 |
| 材料和方法 | 第18-24页 |
| 1 实验材料 | 第18-20页 |
| ·细胞、菌株、病毒和载体 | 第18页 |
| ·主要工具酶与试剂 | 第18页 |
| ·寡核苷酸引物的合成 | 第18页 |
| ·细菌培养基的制备 | 第18页 |
| ·细胞培养基及所用溶液的制备 | 第18-20页 |
| 2 实验方法 | 第20-24页 |
| ·细胞培养 | 第20页 |
| ·重组病毒Ac-hIL12的空斑纯化 | 第20-21页 |
| ·Ac-hIL12在SF9中的连续无稀释传代 | 第21页 |
| ·Ac-hIL12胞内病毒(ICV)DNA的抽提 | 第21页 |
| ·Ac-hIL12中2.0kb片段的PCR扩增与克隆 | 第21-24页 |
| ·DNA序列的测定与分析 | 第24页 |
| 结果 | 第24-27页 |
| 1 Ac-hIL12中2.0kb片段的PCR扩增及其克隆 | 第24-25页 |
| 2 2.0kb片段的序列测定及其分析 | 第25-27页 |
| ·hIL-12基因序列突变分析 | 第25-26页 |
| ·启动子P10和Polyhedrin突变序列分析 | 第26-27页 |
| 讨论 | 第27-29页 |
| 1 2.0DNA片段的PCR扩增 | 第27页 |
| 2 hIL-12基因的突变分析 | 第27页 |
| 3 Polyhedrin启动子和P10启动子 | 第27-29页 |
| 第二章 hIL-12在巴斯德毕赤酵母中的表达 | 第29-60页 |
| 前言 | 第29-32页 |
| 1 巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)表达系统 | 第29-31页 |
| 2 细小病毒内核糖体进入位点(IRES) | 第31页 |
| 3 本研究的目的和意义 | 第31-32页 |
| 材料和方法 | 第32-45页 |
| 1 载体与菌种 | 第32页 |
| 2 试剂 | 第32-33页 |
| 3 引物合成 | 第33页 |
| 4 培养基及常用溶液的配制 | 第33-35页 |
| 5 目的片段的PCR扩增及其T-clone载体的构建 | 第35-37页 |
| 6 重组质粒的转化与阳性重组子的筛选 | 第37-38页 |
| 7 表达克隆载体pPIC6α C(ClaⅠ、NotⅠ)的制备与纯化 | 第38页 |
| 8 含酵母分泌肽p40(p40α)的制备 | 第38-39页 |
| 9 重组表达质粒pPIC6α C／p35-IRES-p40α的构建及阳性重组子的筛选 | 第39-42页 |
| 10 转化酵母重组质粒的线性化与纯化 | 第42页 |
| 11 重组表达质粒转化Pichia Pastoris X-33 | 第42-43页 |
| 12 重组酵母菌X-33／pPIC6α C／p35-IRES-p40α的筛选与鉴定 | 第43-44页 |
| 13 IL-12在酵母中的诱导表达 | 第44-45页 |
| 14 重组酵母表达产物hIL-12的检测 | 第45页 |
| 15 高表达重组菌株的筛选 | 第45页 |
| 16 诱导时间对表达量的影响 | 第45页 |
| 结果 | 第45-53页 |
| 1 目的片段的PCR扩增及其T-clone载体的构建 | 第45-46页 |
| 2 将p40改造成含酵母分泌肽α-factor的p40α cDNA | 第46-48页 |
| 3 重组表达质粒pPIC6α C／p35-IRES-p40α的构建 | 第48-50页 |
| 4 重组酵母菌X-33(pPIC6α C／p35-IRES-p40α)的筛选与鉴定 | 第50-51页 |
| 5 hIL-12在重组酵母的表达及表达产物的检测 | 第51-53页 |
| 讨论 | 第53-60页 |
| 1 IRES序列的引物设计和PCR扩增 | 第53页 |
| 2 含酵母分泌肽p40α cDNA的改造和PCR扩增 | 第53-54页 |
| 3 重组表达质粒pPIC6α C／p35-IRES-p40α的构建 | 第54-55页 |
| 4 转化子表型及产生 | 第55页 |
| 5 hIL-12在毕赤酵母中的诱导表达 | 第55-56页 |
| 6 hIL-12在毕赤酵母中的表达 | 第56页 |
| 7 表达产物hIL-12的检测 | 第56-57页 |
| 8 细小病毒IRES | 第57-58页 |
| 9 影响hIL-12在酵母中表达的因素 | 第58-60页 |
| 小结 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-68页 |
| 发表论文 | 第68-69页 |
| 致谢 | 第69-70页 |
