中文摘要 | 第1-13页 |
前言 | 第13-15页 |
第一章 文献综述 | 第15-42页 |
第一节 1,3-丙二醇生产现状及应用前景 | 第15-23页 |
一、1,3-丙二醇概况 | 第15页 |
二、1,3-丙二醇的应用 | 第15-16页 |
三、1,3-丙二醇的生产历史和现状 | 第16-17页 |
四、1,3-丙二醇生物合成法的研究进展 | 第17-22页 |
五、1,3-丙二醇生物合成法存在问题及对策 | 第22页 |
六、基因改造的应用前景与未来与展望 | 第22-23页 |
第二节 1,3-丙二醇生物合成途径和1,3-丙二醇合成酶 | 第23-29页 |
一、1,3-丙二醇生物合成途径 | 第23-24页 |
二、1,3-丙二醇合成酶 | 第24-29页 |
第三节 1,3-丙二醇生物合成途径中限速酶—甘油脱水酶的研究进展 | 第29-38页 |
一、甘油脱水酶的概况 | 第29页 |
二、甘油脱水酶的结构与性质 | 第29-32页 |
三、甘油脱水酶基因的分子结构 | 第32-33页 |
四、甘油脱水酶基因工程的国内外研究进展 | 第33-35页 |
五、本研究的目的和意义 | 第35-37页 |
六、实验整体技术路线 | 第37-38页 |
参考文献 | 第38-42页 |
第二章 肺炎克氏杆菌发酵生产1,3-丙二醇的研究 | 第42-55页 |
摘要 | 第42页 |
前言 | 第42-43页 |
一、材料和方法 | 第43-44页 |
1、培养方法 | 第43-44页 |
2、厌氧培养基的制备 | 第44页 |
3、测定方法 | 第44页 |
4、生长曲线测定 | 第44页 |
5、细菌形态的观察方法 | 第44页 |
二、结果与分析 | 第44-50页 |
三、讨论 | 第50-52页 |
(一) 关于发酵培养基对1,3-丙二醇产量的影响 | 第50-51页 |
(二) 关于发酵培养方式对1,3-丙二醇产量的影响 | 第51-52页 |
(三) 关于甘油两种代谢途径对1,3-丙二醇的产量的影响 | 第52页 |
本章小结 | 第52-53页 |
参考文献 | 第53-55页 |
第三章 肺炎克氏杆菌甘油脱水酶基因的克隆及序列分析 | 第55-99页 |
摘要 | 第55页 |
前言 | 第55-56页 |
第一节 基因组DNA 的提取及目的酶基因引物的筛选 | 第56-62页 |
一、材料和方法 | 第56-61页 |
1、肺炎克氏杆菌基因组DNA 的提取与纯化 | 第58-59页 |
2、 1% 琼脂糖凝胶电泳分析 | 第59-60页 |
3、目的酶基因引物的设计 | 第60页 |
4、从不同基因组DNA 中进行PCR 扩增 | 第60-61页 |
二、结果与分析 | 第61-62页 |
第二节 甘油脱水酶α亚基基因的克隆、鉴定与序列分析 | 第62-79页 |
一、材料与方法 | 第62-69页 |
1、PCR 方法扩增gldA 基因 | 第64页 |
2、目的扩增片段的回收 | 第64-65页 |
3、PCR 产物与pMD18-T 载体直接连接 | 第65页 |
4、感受态细胞的制备 | 第65-66页 |
5、重组质粒的转化 | 第66页 |
6、菌落PCR 筛选阳性克隆 | 第66-67页 |
7、植菌 | 第67页 |
8、质粒的小量提取与纯化 | 第67-68页 |
9、重组质粒pMD18-T-gldA 的酶切鉴定和PCR 鉴定 | 第68-69页 |
10、重组质粒pMD18-T-gldA 的测序鉴定 | 第69页 |
二、结果与分析 | 第69-79页 |
第三节 甘油脱水酶β亚基基因的克隆与序列分析 | 第79-86页 |
一、材料与方法 | 第79-81页 |
二、结果与分析 | 第81-86页 |
第四节 甘油脱水酶γ亚基基因的克隆与序列分析 | 第86-93页 |
一、材料与方法 | 第86-87页 |
二、结果与分析 | 第87-93页 |
第五节 讨论 | 第93-96页 |
一、关于肺炎克氏杆菌菌株基因组DNA 的提取 | 第93页 |
二、关于引物设计 | 第93-95页 |
三、关于PCR 反应 | 第95-96页 |
本章小结 | 第96-97页 |
参考文献 | 第97-99页 |
第四章 肺炎克氏杆菌甘油脱水酶单亚基基因表达载体的构建 | 第99-127页 |
摘要 | 第99页 |
前言 | 第99-100页 |
第一节 甘油脱水酶α亚基基因的表达载体的构建 | 第100-109页 |
一、材料与方法 | 第100-105页 |
1、PCR 方法从质粒pMD18-T-gldA 中扩增gldA 基因 | 第101-102页 |
2、PCR 扩增产物回收 | 第102页 |
3、PCR 回收产物的酶切处理 | 第102页 |
4、空的表达载体pMAL-c2X 的Xmn I 酶切处理 | 第102-103页 |
5、经 Xmn I 酶切后的表达载体pMAL-c2X 的 Xba I 酶切处理 | 第103页 |
6、PCR 产物和pMAL-c2X 载体连接 | 第103页 |
7、重组质粒的电转化 | 第103-104页 |
8、菌落PCR 筛选阳性克隆 | 第104页 |
9、质粒的提取与纯化 | 第104页 |
10、重组质粒pMAL-gldA 的酶切鉴定和PCR 鉴定 | 第104-105页 |
11、重组质粒pMAL-gldA 的测序鉴定 | 第105页 |
二、结果与分析 | 第105-109页 |
第二节 甘油脱水酶β亚基基因的表达载体的构建 | 第109-116页 |
一、材料与方法 | 第109-113页 |
二、结果与分析 | 第113-116页 |
第三节 甘油脱水酶γ亚基基因的表达载体的构建 | 第116-123页 |
一、材料与方法 | 第116-120页 |
二、结果与分析 | 第120-123页 |
第四节 讨论 | 第123-125页 |
一、关于基因克隆方式的选择 | 第123页 |
二、关于定向克隆时酶切位点的选择 | 第123-124页 |
三、关于载体构建 | 第124-125页 |
本章小结 | 第125页 |
参考文献 | 第125-127页 |
第五章 肺炎克氏杆菌甘油脱水酶三亚基基因表达载体的构建 | 第127-153页 |
摘要 | 第127页 |
前言 | 第127-128页 |
第一节 甘油脱水酶基因在表达载体pMAL-c2X 上的构建 | 第128-139页 |
一、材料与方法 | 第128-134页 |
1、融合基因gldBC 的合成和克隆载体pSIM-gldBC 的构建 | 第129-132页 |
2、融合表达载体pMAL-gldABC 的构建 | 第132-134页 |
二、结果与分析 | 第134-139页 |
第二节 甘油脱水酶基因在表达载体pGEX-4T-1 上的构建 | 第139-149页 |
一、材料与方法 | 第139-146页 |
1、融合表达载体pGEX-gldBC 的构建 | 第139-141页 |
2、克隆载体pSIM-T-gldA 的构建 | 第141-143页 |
3、融合表达载体pGEX-gldABC 的构建 | 第143-146页 |
二、结果与分析 | 第146-149页 |
第三节 讨论 | 第149-151页 |
一、关于高效表达载体的选择 | 第149-150页 |
二、关于同向串联表达载体的构建 | 第150-151页 |
本章小结 | 第151页 |
参考文献 | 第151-153页 |
第六章 结论与展望 | 第153-158页 |
一、主要结论 | 第153-155页 |
二、本论文创新点 | 第155页 |
三、有待于进一步开展的工作 | 第155-156页 |
四、展望 | 第156-158页 |
致谢 | 第158-159页 |
英文摘要 | 第159-161页 |
攻读博士学位期间发表的学术论文 | 第161页 |