| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 缩略语表(Abbreviation) | 第11-13页 |
| 1 文献综述 | 第13-34页 |
| ·猪链球菌的简介 | 第13-22页 |
| ·猪链球菌的生物学特性 | 第13页 |
| ·猪链球菌的流行病学 | 第13-14页 |
| ·毒力因子 | 第14-20页 |
| ·猪链球菌溶血素 | 第14-15页 |
| ·荚膜多糖 | 第15-16页 |
| ·溶菌酶释放蛋白和胞外蛋白因子 | 第16页 |
| ·IgG结合蛋白 | 第16-17页 |
| ·黏附 | 第17页 |
| ·纤连蛋白结合蛋白 | 第17页 |
| ·透明质酸裂解酶 | 第17-18页 |
| ·Sortase | 第18页 |
| ·致病性基因-ORF2 | 第18-19页 |
| ·38 KDa免疫保护性抗原 | 第19页 |
| ·谷氨酸脱氢酶蛋白 | 第19页 |
| ·血清透明因子 | 第19-20页 |
| ·其它 | 第20页 |
| ·致病机理 | 第20-22页 |
| ·猪链球菌2型SntA蛋白的简介 | 第22-23页 |
| ·猪链球菌2型与宿主间相互作用的意义及方式 | 第23-26页 |
| ·中性粒细胞 | 第23页 |
| ·巨噬细胞/单核细胞 | 第23-24页 |
| ·上皮细胞 | 第24-25页 |
| ·脉络丛上皮细胞 | 第25页 |
| ·血管内皮细胞 | 第25-26页 |
| ·其他 | 第26页 |
| ·研究病原菌与宿主间蛋白相互作用的方法 | 第26-33页 |
| ·噬菌体展示技术 | 第26-27页 |
| ·等离子共振技术 | 第27页 |
| ·荧光能量转移技术 | 第27页 |
| ·抗体与蛋白质阵列技术 | 第27页 |
| ·免疫共沉淀技术 | 第27-28页 |
| ·Pull-down技术 | 第28页 |
| ·酵母双杂交系统 | 第28-33页 |
| ·酵母双杂交系统的作用原理 | 第28-29页 |
| ·酵母双杂交系统的应用 | 第29-31页 |
| ·酵母双杂交系统的优点 | 第31页 |
| ·酵母双杂交系统中的常见问题 | 第31页 |
| ·基于酵母双杂交系统的其它杂交系统 | 第31-33页 |
| ·课题研究目的和意义 | 第33-34页 |
| 2 材料与方法 | 第34-52页 |
| ·材料 | 第34-42页 |
| ·动物品系 | 第34页 |
| ·菌株和质粒 | 第34-37页 |
| ·培养基、抗生素配制 | 第37-38页 |
| ·主要试剂来源 | 第38页 |
| ·使用溶液及储存液 | 第38-41页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳相关溶液 | 第38-39页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液 | 第39页 |
| ·酵母转化相关溶液 | 第39页 |
| ·酵母β-半乳糖苷酶检测法相关溶液 | 第39-40页 |
| ·保菌用甘油 | 第40页 |
| ·Westen-blot相关溶液 | 第40页 |
| ·蛋白纯化与Pull-down相关试剂 | 第40-41页 |
| ·寡核甘酸引物 | 第41-42页 |
| ·方法 | 第42-52页 |
| ·酵母双杂交cDNA文库的构建 | 第42-44页 |
| ·猪脑组织与肺组织RNA的提取 | 第42页 |
| ·双链cDNA的合成 | 第42-44页 |
| ·pGADT7-Rec质粒分别与猪脑双链cDNA及肺双链cDNA共转AH109感受态细胞 | 第44-45页 |
| ·酵母菌株AH109营养表型的验证 | 第44页 |
| ·酵母感受态细胞的小量制备 | 第44-45页 |
| ·共转AH109感受态细胞 | 第45页 |
| ·酵母文库的收集及分析 | 第45-46页 |
| ·酵母文库的收集 | 第45-46页 |
| ·酵母文库的鉴定 | 第46页 |
| ·猪链球菌2型基因组的提取 | 第46页 |
| ·sntA基因的克隆 | 第46-47页 |
| ·酵母双杂交重组诱饵质粒的转化、自激活及毒性检测 | 第47-48页 |
| ·酵母菌株Y187营养表型的验证 | 第47页 |
| ·酵母菌株Y187感受态细胞的小量制备 | 第47页 |
| ·诱饵质粒pGBKT7-sntA-N与pGBKT7-sntA-C分别转化Y187感受态细胞 | 第47页 |
| ·pGBKT7-sntA-N与pGBKT7-sntA-C分别转化Y187后的自激活检测 | 第47页 |
| ·转化的pGBKT7-sntA-N与pGBKT7-sntA-C对Y187毒性的检测 | 第47-48页 |
| ·酵母双杂交文库的筛选 | 第48-49页 |
| ·酵母双杂交阳性克隆子的鉴定 | 第49页 |
| ·菌落PCR初步筛选 | 第49页 |
| ·β-半乳糖苷酶检测lacZ报告基因的表达 | 第49页 |
| ·酵母质粒的提取 | 第49页 |
| ·阳性质粒测序,blast分析 | 第49页 |
| ·阳性克隆子回转验证 | 第49页 |
| ·体外蛋白质相互作用的Pull-down验证 | 第49-52页 |
| ·pTYB12-AOP2与pTYB12-C1qA载体的构建 | 第49页 |
| ·pTYB12-AOP2与pTYB12-C1qA靶蛋白诱导表达分析 | 第49-50页 |
| ·pTYB12-AOP2与pTYB12-C1qA融合蛋白的纯化 | 第50-51页 |
| ·pET28a-SntA-N蛋白的表达 | 第51页 |
| ·pET28a-SntA-N蛋白的纯化 | 第51页 |
| ·pTYB12-AOP2和pTYB12-C1qA融合蛋白分别与pET28a-SntA-N蛋白的Pull-down验证 | 第51-52页 |
| ·Western-blotting检测 | 第52页 |
| ·生物信息学分析方法 | 第52页 |
| ·分析蛋白二级结构 | 第52页 |
| ·预测作用位点 | 第52页 |
| 3.结果与分析 | 第52-61页 |
| ·酵母菌株Y187及AH109营养表型的验证 | 第52页 |
| ·猪脑组织酵母双杂交cDNA文库的制备 | 第52-53页 |
| ·猪脑组织mRNA的提取 | 第52页 |
| ·LD-PCR制备脑双链cDNA片段 | 第52-53页 |
| ·猪脑组织酵母文库的收集及分析 | 第53页 |
| ·猪脑组织酵母文库的进一步鉴定 | 第53页 |
| ·猪肺组织酵母双杂交cDNA文库的制备 | 第53-55页 |
| ·猪肺组织RNA的提取 | 第53页 |
| ·LD-PCR制备肺双链cDNA片段 | 第53-55页 |
| ·猪肺组织酵母文库的收集及分析 | 第55页 |
| ·猪肺组织酵母文库的进一步鉴定 | 第55页 |
| ·sntA基因的扩增与克隆 | 第55-56页 |
| ·sntA基因的序列分析 | 第55-56页 |
| ·sntA基因的克隆 | 第56页 |
| ·重组诱饵质粒pGBKT7-sntA-N与pGBKT7-sntA-C的构建与鉴定 | 第56页 |
| ·酵母双杂交重组诱饵质粒的酵母转化及相关检测 | 第56页 |
| ·pGBKT7-sntA-N与pGBKT7-sntA-C分别转化Y187后的自激活检测 | 第56页 |
| ·pGBKT7-sntA-N与pGBKT7-sntA-C分别对Y187毒性的检测 | 第56页 |
| ·SntA-N与SntA-C蛋白分别与猪脑组织酵母文库互作蛋白的筛选与鉴定 | 第56-58页 |
| ·阳性克隆的营养缺陷型筛选 | 第56页 |
| ·β-半乳糖苷酶检测阳性克隆子 | 第56-57页 |
| ·阳性克隆片段的测序与分析 | 第57-58页 |
| ·阳性克隆子回转验证 | 第58页 |
| ·体外蛋白质相互作用的Pull-down与Western-blotting验证 | 第58-60页 |
| ·生物信息学预测SntA-N蛋白与AOP2及C1qA蛋白相互作用位点 | 第60-61页 |
| 4 讨论 | 第61-64页 |
| ·酵母双杂交文库的构建 | 第61页 |
| ·酵母双杂交技术筛选链球菌与宿主发生互作的蛋白 | 第61-62页 |
| ·SntA蛋白与致病性的关系 | 第62页 |
| ·酵母双杂交系统的假阳性 | 第62-63页 |
| ·Pull-down体外验证实验 | 第63页 |
| ·SntA与宿主免疫逃避的关系 | 第63页 |
| ·SntA与细胞损伤的关系 | 第63-64页 |
| 结论与展望 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-71页 |
| 致谢 | 第71页 |
