| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-10页 |
| 1 引言 | 第10-22页 |
| ·人博卡病毒HBoV的简介 | 第10-15页 |
| ·人博卡病毒的发现、命名及分类 | 第10页 |
| ·人博卡病毒染色体组分析 | 第10-13页 |
| ·人博卡病毒的流行病学特征 | 第13-14页 |
| ·人博卡病毒感染后的临床症状 | 第14-15页 |
| ·人博卡病毒的诊断、检测方法 | 第15页 |
| ·人博卡病毒的致病机理 | 第15页 |
| ·pMAL~(TM)原核表达系统(参考NEB公司pMAL~(TM)蛋白融合和纯化系统手册) | 第15-17页 |
| ·pMAL~(TM)原核表达系统简介 | 第15-16页 |
| ·质粒pMAL-c2X(Amp抗性)的相关信息及克隆策略 | 第16-17页 |
| ·pET原核表达系统(参考Novagen公司第10版pET系统操作手册) | 第17-19页 |
| ·pET原核表达系统简介 | 第17页 |
| ·质粒pET28a(Kan抗性)的相关信息及克隆策略 | 第17-18页 |
| ·原核表达载体pET28a克隆及表达的基本流程 | 第18-19页 |
| ·Bac-to-Bac杆状病毒真核表达系统(参考Ivitrogen公司Bac-to-Bac(?)Baculovirus Expression System操作手册) | 第19-20页 |
| ·Bac-to-Bac杆状病毒真核表达系统简介 | 第19页 |
| ·Bac-to-Bac杆状病毒真核表达系统pFastBac载体 | 第19-20页 |
| ·Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的原理 | 第20页 |
| ·本文研究的目的和意义 | 第20-22页 |
| 2 实验材料和方法 | 第22-33页 |
| ·主要实验仪器 | 第22页 |
| ·主要实验材料 | 第22-24页 |
| ·菌株、质粒和细胞 | 第22页 |
| ·药品和试剂 | 第22-23页 |
| ·细菌培养基与试剂配制 | 第23页 |
| ·常用溶液及配制 | 第23-24页 |
| ·实验方法 | 第24-33页 |
| ·DNA的提取 | 第24-25页 |
| ·VP1和VP2目的基因的PCR扩增 | 第25-26页 |
| ·DNA片段的切胶回收 | 第26-27页 |
| ·含VP1和VP2序列重组质粒的构建 | 第27-28页 |
| ·阳性克隆的筛选和鉴定 | 第28页 |
| ·融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测 | 第28页 |
| ·融合蛋白经Western Blot检测 | 第28-29页 |
| ·诱导表达条件的优化 | 第29页 |
| ·pMAL-c2X-VP2融合蛋白的分离纯化 | 第29-30页 |
| ·HBoV-VP2多克隆抗体的制备 | 第30页 |
| ·Western Blot检测抗体免疫学活性 | 第30页 |
| ·Bac-to-Bac杆状病毒表达系统检测VP1基因的表达 | 第30-33页 |
| 3 实验结果 | 第33-44页 |
| ·以pMAL-c2X为载体进行结构蛋白的原核表达、纯化 | 第33-36页 |
| ·VP1和VP2的PCR扩增 | 第33页 |
| ·重组质粒pMAL-c2X-VP1和pMAL-c2X-VP2的双酶切鉴定 | 第33-34页 |
| ·重组质粒的序列测定 | 第34页 |
| ·SDS-PAGE检测融合蛋白的原核表达 | 第34页 |
| ·Western-Blot检测融合蛋白的原核表达 | 第34-35页 |
| ·pMal-c2x-VP2融合蛋白纯化后的检测 | 第35页 |
| ·pMal-c4x-VP2融合蛋白的诱导表达及Western Blot检测 | 第35-36页 |
| ·以pET28a为载体进行结构蛋白的原核表达、纯化 | 第36-40页 |
| ·VP1和VP2的PCR扩增 | 第36页 |
| ·重组质粒pET28a-VP1和pET28a-VP2的双酶切鉴定 | 第36-37页 |
| ·SDS-PAGE检测融合蛋白的原核表达 | 第37页 |
| ·Western Blot检测融合蛋白的原核表达 | 第37-38页 |
| ·pET28a-VP2融合蛋白纯化后的检测 | 第38页 |
| ·Western Blot检测纯化后的融合蛋白 | 第38-39页 |
| ·重组质粒pET28a-VP2的序列测定 | 第39页 |
| ·重新构建重组质粒pET28a-VP2 | 第39页 |
| ·SDS-PAGE检测融合蛋白的诱导表达 | 第39-40页 |
| ·VP1蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒系统中的表达 | 第40-44页 |
| ·VP1序列的PCR扩增(以pFastBac HTA载体) | 第40页 |
| ·pFastBac HTA-VP1重组质粒酶切鉴定 | 第40-41页 |
| ·pFastBac HTA-VP1重组质粒序列测定 | 第41页 |
| ·pFastBac HTA-VP1重组质粒转座及鉴定 | 第41-42页 |
| ·重组Bacmid DNA转染Sf9细胞 | 第42页 |
| ·扩大培养 | 第42-43页 |
| ·Western Blot检测VP1基因和VPl-u基因的表达 | 第43-44页 |
| 4 讨论和展望 | 第44-48页 |
| ·讨论及结果分析 | 第44-46页 |
| ·以pMAL-c2X和pET28a分别为载体构建含目的基因重组质粒 | 第44页 |
| ·结构蛋白的原核表达与纯化 | 第44-46页 |
| ·Bac-to-Bac杆状病毒表达系统检测VP1、VP1-u基因的表达 | 第46页 |
| ·总结和展望 | 第46-48页 |
| 参考文献 | 第48-52页 |
| 硕士期间发表论文 | 第52-53页 |
| 致谢 | 第53-54页 |
