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5-氨基乙酰丙酸生产菌的代谢工程构建

摘要第4-6页
ABSTRACT第6-7页
1 前言第11-23页
    1.1 引言第11页
    1.2 ALA的应用第11-13页
        1.2.1 ALA在医药领域的应用第11-12页
        1.2.2 ALA在农业中的应用第12-13页
    1.3 ALA的开发前景第13-14页
    1.4 ALA的合成第14-15页
        1.4.1 化学法合成ALA第14页
        1.4.2 生物法合成ALA第14-15页
    1.5 ALA的生物合成途径及调控第15-17页
        1.5.1 ALA的生物合成途径第15-16页
        1.5.2 ALA的生物合成的调控第16-17页
    1.6 ALA生产菌株的代谢工程研究进展第17-18页
    1.7 利用C.glutamicum合成ALA的优势第18-19页
    1.8 立题背景第19-23页
        1.8.1 研究内容第19-21页
        1.8.2 技术路线第21-23页
2 材料和方法第23-44页
    2.1 实验材料第23-29页
        2.1.1 菌株及质粒第23-25页
        2.1.2 实验引物第25-29页
    2.2 主要仪器和试剂第29-33页
        2.2.1 主要仪器第29-30页
        2.2.2 主要试剂第30-32页
        2.2.3 主要溶液第32-33页
        2.2.4 培养基第33页
    2.3 实验方法第33-41页
        2.3.1 谷氨酸棒杆菌基因组的提取第33-34页
        2.3.2 质粒提取第34页
        2.3.3 DNA纯化回收第34页
        2.3.4 大肠杆菌化学转化法感受态细胞的制备及转化实验第34-35页
        2.3.5 谷氨酸棒杆菌电转化法感受态细胞的制备及转化第35-36页
        2.3.6 PCR扩增第36-37页
        2.3.7 琼脂糖凝胶电泳第37-38页
        2.3.8 质粒的构建第38-39页
        2.3.9 谷氨酸棒杆菌同源重组基因敲除或整合方法[62]第39-41页
    2.4 分析方法第41-44页
        2.4.1 发酵液中的生物量的测定第41页
        2.4.2 Glu检测方法第41-42页
        2.4.3 发酵液中的ALA检测方法第42-44页
3 结果与讨论第44-74页
    3.1 增加前体物谷氨酸供给的代谢工程育种第44-50页
        3.1.1 过表达gltA对谷氨酸积累的影响第44-46页
        3.1.2 过表达icd对谷氨酸积累的影响第46-47页
        3.1.3 转运蛋白Ncgl1221的敲除对谷氨酸积累的影响第47-48页
        3.1.4 增强Glu改造菌株发酵第48-50页
        3.1.5 小结第50页
    3.2 Glu到ALA合成途径增强的代谢育种第50-55页
        3.2.1 C.glutamicum ATCC 13032中自身关键酶基因的强化第51-53页
        3.2.2 异源关键酶hemA和hemL的过表达第53-55页
        3.2.3 小结第55页
    3.3 增强辅酶和能量供给的代谢育种第55-65页
        3.3.1 增强NADPH的供应对ALA合成的影响第55-56页
        3.3.2 增强ATP供应对ALA合成的影响第56-57页
        3.3.3 关键酶PLP的供应对ALA合成的影响第57-58页
        3.3.4 能量和辅酶供给菌株发酵第58-60页
        3.3.5 不同启动子控制pntAB表达第60-64页
        3.3.6 NADPH含量测定第64-65页
        3.3.7 小结第65页
    3.4 ALA降解途径的切断或减弱的代谢育种第65-69页
        3.4.1 hemB基因的敲除尝试第65-66页
        3.4.2 利用Crispri技术干扰hemB第66页
        3.4.3 hemB干扰菌株发酵第66-67页
        3.4.4 hemB基因的化学抑制第67页
        3.4.5 添加化学抑制剂发酵第67-69页
        3.4.6 小结第69页
    3.5 增强ALA运输到胞外能力的代谢育种第69-74页
        3.5.1 过表rhtA对ALA合成的影响第69-70页
        3.5.2 过表达thrE对ALA合成的影响第70-71页
        3.5.3 ALA转运增强菌株发酵第71-73页
        3.5.4 小结第73-74页
4 结论第74-76页
    4.1 实验结论第74-75页
    4.2 本文创新点第75页
    4.3 本文不足之处第75-76页
5 展望第76-77页
6 参考文献第77-85页
7 硕士期间发表论文情况第85-86页
8 致谢第86-87页
9 附录第87-88页

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