| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 1 前言 | 第11-23页 |
| 1.1 引言 | 第11页 |
| 1.2 ALA的应用 | 第11-13页 |
| 1.2.1 ALA在医药领域的应用 | 第11-12页 |
| 1.2.2 ALA在农业中的应用 | 第12-13页 |
| 1.3 ALA的开发前景 | 第13-14页 |
| 1.4 ALA的合成 | 第14-15页 |
| 1.4.1 化学法合成ALA | 第14页 |
| 1.4.2 生物法合成ALA | 第14-15页 |
| 1.5 ALA的生物合成途径及调控 | 第15-17页 |
| 1.5.1 ALA的生物合成途径 | 第15-16页 |
| 1.5.2 ALA的生物合成的调控 | 第16-17页 |
| 1.6 ALA生产菌株的代谢工程研究进展 | 第17-18页 |
| 1.7 利用C.glutamicum合成ALA的优势 | 第18-19页 |
| 1.8 立题背景 | 第19-23页 |
| 1.8.1 研究内容 | 第19-21页 |
| 1.8.2 技术路线 | 第21-23页 |
| 2 材料和方法 | 第23-44页 |
| 2.1 实验材料 | 第23-29页 |
| 2.1.1 菌株及质粒 | 第23-25页 |
| 2.1.2 实验引物 | 第25-29页 |
| 2.2 主要仪器和试剂 | 第29-33页 |
| 2.2.1 主要仪器 | 第29-30页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第30-32页 |
| 2.2.3 主要溶液 | 第32-33页 |
| 2.2.4 培养基 | 第33页 |
| 2.3 实验方法 | 第33-41页 |
| 2.3.1 谷氨酸棒杆菌基因组的提取 | 第33-34页 |
| 2.3.2 质粒提取 | 第34页 |
| 2.3.3 DNA纯化回收 | 第34页 |
| 2.3.4 大肠杆菌化学转化法感受态细胞的制备及转化实验 | 第34-35页 |
| 2.3.5 谷氨酸棒杆菌电转化法感受态细胞的制备及转化 | 第35-36页 |
| 2.3.6 PCR扩增 | 第36-37页 |
| 2.3.7 琼脂糖凝胶电泳 | 第37-38页 |
| 2.3.8 质粒的构建 | 第38-39页 |
| 2.3.9 谷氨酸棒杆菌同源重组基因敲除或整合方法[62] | 第39-41页 |
| 2.4 分析方法 | 第41-44页 |
| 2.4.1 发酵液中的生物量的测定 | 第41页 |
| 2.4.2 Glu检测方法 | 第41-42页 |
| 2.4.3 发酵液中的ALA检测方法 | 第42-44页 |
| 3 结果与讨论 | 第44-74页 |
| 3.1 增加前体物谷氨酸供给的代谢工程育种 | 第44-50页 |
| 3.1.1 过表达gltA对谷氨酸积累的影响 | 第44-46页 |
| 3.1.2 过表达icd对谷氨酸积累的影响 | 第46-47页 |
| 3.1.3 转运蛋白Ncgl1221的敲除对谷氨酸积累的影响 | 第47-48页 |
| 3.1.4 增强Glu改造菌株发酵 | 第48-50页 |
| 3.1.5 小结 | 第50页 |
| 3.2 Glu到ALA合成途径增强的代谢育种 | 第50-55页 |
| 3.2.1 C.glutamicum ATCC 13032中自身关键酶基因的强化 | 第51-53页 |
| 3.2.2 异源关键酶hemA和hemL的过表达 | 第53-55页 |
| 3.2.3 小结 | 第55页 |
| 3.3 增强辅酶和能量供给的代谢育种 | 第55-65页 |
| 3.3.1 增强NADPH的供应对ALA合成的影响 | 第55-56页 |
| 3.3.2 增强ATP供应对ALA合成的影响 | 第56-57页 |
| 3.3.3 关键酶PLP的供应对ALA合成的影响 | 第57-58页 |
| 3.3.4 能量和辅酶供给菌株发酵 | 第58-60页 |
| 3.3.5 不同启动子控制pntAB表达 | 第60-64页 |
| 3.3.6 NADPH含量测定 | 第64-65页 |
| 3.3.7 小结 | 第65页 |
| 3.4 ALA降解途径的切断或减弱的代谢育种 | 第65-69页 |
| 3.4.1 hemB基因的敲除尝试 | 第65-66页 |
| 3.4.2 利用Crispri技术干扰hemB | 第66页 |
| 3.4.3 hemB干扰菌株发酵 | 第66-67页 |
| 3.4.4 hemB基因的化学抑制 | 第67页 |
| 3.4.5 添加化学抑制剂发酵 | 第67-69页 |
| 3.4.6 小结 | 第69页 |
| 3.5 增强ALA运输到胞外能力的代谢育种 | 第69-74页 |
| 3.5.1 过表rhtA对ALA合成的影响 | 第69-70页 |
| 3.5.2 过表达thrE对ALA合成的影响 | 第70-71页 |
| 3.5.3 ALA转运增强菌株发酵 | 第71-73页 |
| 3.5.4 小结 | 第73-74页 |
| 4 结论 | 第74-76页 |
| 4.1 实验结论 | 第74-75页 |
| 4.2 本文创新点 | 第75页 |
| 4.3 本文不足之处 | 第75-76页 |
| 5 展望 | 第76-77页 |
| 6 参考文献 | 第77-85页 |
| 7 硕士期间发表论文情况 | 第85-86页 |
| 8 致谢 | 第86-87页 |
| 9 附录 | 第87-88页 |
