| 英文缩略词 | 第7-9页 |
| 中文摘要 | 第9-11页 |
| 英文摘要 | 第11-12页 |
| 前言 | 第13-17页 |
| 1. 材料和方法 | 第17-69页 |
| 1.1 实验材料和试剂配制 | 第17-29页 |
| 1.1.1 实验仪器 | 第17-18页 |
| 1.1.2 实验耗材 | 第18-19页 |
| 1.1.3 实验试剂 | 第19-22页 |
| 1.1.4 溶液配制 | 第22-26页 |
| 1.1.5 细胞系 | 第26页 |
| 1.1.6 菌株及载体 | 第26-29页 |
| 1.1.7 实验动物 | 第29页 |
| 1.2 实验方法 | 第29-69页 |
| 1.2.1 HEK293T细胞系及各非小细胞肺癌细胞系的培养 | 第29-32页 |
| 1.2.1.1 细胞复苏 | 第29-30页 |
| 1.2.1.2 细胞换液 | 第30页 |
| 1.2.1.3 细胞计数及传代 | 第30-32页 |
| 1.2.1.4 细胞冻存 | 第32页 |
| 1.2.2 HEK293T细胞系EML4-ALK融合基因状态验证 | 第32-34页 |
| 1.2.2.1 HEK293T、H3122及H2228细胞总RNA提取 | 第32-33页 |
| 1.2.2.2 RT-qPCR方法验证HEK293T细胞EML4-ALK融合基因状态 | 第33-34页 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas9技术构建EML4-ALK融合基因阳性细胞系 | 第34-55页 |
| 1.2.3.1 靶位点选择及sgRNA设计 | 第34-38页 |
| 1.2.3.2 CRISPR/Cas9表达载体的构建及鉴定 | 第38-42页 |
| 1.2.3.3 携带不同sgRNA的CRISPR/Cas9表达载体筛选 | 第42-48页 |
| 1.2.3.4 EML4-ALK融合基因阳性混合克隆制备及验证 | 第48-54页 |
| 1.2.3.5 EML4-ALK融合基因阳性单克隆细胞筛选 | 第54-55页 |
| 1.2.4 基于CRISPR/Cas9技术构建的EML4-ALK融合基因阳性细胞系验证 | 第55-60页 |
| 1.2.4.1 DNA水平验证 | 第55页 |
| 1.2.4.2 RNA水平验证 | 第55-56页 |
| 1.2.4.3 蛋白水平验证 | 第56-60页 |
| 1.2.5 携带相关EML4-ALK融合基因的异种移植动物模型建立 | 第60-61页 |
| 1.2.5.1 实验动物的准备 | 第60页 |
| 1.2.5.2 接种细胞悬液制备 | 第60-61页 |
| 1.2.5.3 动物接种 | 第61页 |
| 1.2.5.4 异种移植成瘤观察及动物处死 | 第61页 |
| 1.2.6 新型EML4-ALK融合基因参考物质制备及验证 | 第61-68页 |
| 1.2.6.1 新型EML4-ALK融合基因参考物质制备 | 第62-63页 |
| 1.2.6.2 新型EML4-ALK融合基因参考物质IHC方法验证 | 第63-64页 |
| 1.2.6.3 新型EML4-ALK融合基因参考物质FISH方法验证 | 第64-65页 |
| 1.2.6.4 新型EML4-ALK融合基因参考物质RT-qPCR方法验证 | 第65-66页 |
| 1.2.6.5 新型EML4-ALK融合基因参考物质NGS方法验证 | 第66-68页 |
| 1.2.7 新型EML4-ALK融合基因参考物质均一性及稳定性探究 | 第68-69页 |
| 1.2.7.1 新型EML4-ALK融合基因参考物质均一性研究 | 第68页 |
| 1.2.7.2 新型EML4-ALK融合基因参考物质稳定性研究 | 第68-69页 |
| 2. 结果 | 第69-107页 |
| 2.1 HEK293T细胞系及各非小细胞肺癌细胞系的培养及EML4-ALK融合基因状态验证 | 第69-71页 |
| 2.1.1 HEK293T细胞系及各非小细胞肺癌细胞系的培养 | 第69-70页 |
| 2.1.2 HEK293T细胞系EML4-ALK融合基因状态验证 | 第70-71页 |
| 2.2 CRISPR/CAS9技术构建EML4-ALK融合基因阳性细胞系 | 第71-94页 |
| 2.2.1 EML4-ALK融合基因靶向sgRNA设计 | 第71-72页 |
| 2.2.2 pX330载体验证 | 第72-73页 |
| 2.2.3 pX330-sgRNA重组质粒载体验证 | 第73-79页 |
| 2.2.4 pX330-sgRNA重组质粒载体筛选 | 第79-84页 |
| 2.2.5 混合克隆制备及验证 | 第84-88页 |
| 2.2.6 单克隆细胞筛选 | 第88-94页 |
| 2.3 新型EML4-ALK融合基因阳性细胞系验证 | 第94-99页 |
| 2.3.1 DNA水平验证 | 第94-96页 |
| 2.3.2 RNA水平验证 | 第96-98页 |
| 2.3.3 蛋白质水平验证 | 第98-99页 |
| 2.4 异种移植动物模型建立 | 第99-100页 |
| 2.5 新型EML4-ALK融合基因参考物质制备及验证 | 第100-105页 |
| 2.5.1 新型EML4-ALK融合基因参考物质制备 | 第100-101页 |
| 2.5.2 新型EML4-ALK融合基因参考物质IHC方法验证 | 第101-102页 |
| 2.5.3 新型EML4-ALK融合基因参考物质FISH方法验证 | 第102-103页 |
| 2.5.4 新型EML4-ALK融合基因参考物质RT-qPCR方法验证 | 第103-104页 |
| 2.5.5 新型EML4-ALK融合基因参考物质NGS方法验证 | 第104-105页 |
| 2.6 新型EML4-ALK融合基因参考物质均一性及稳定性探究 | 第105-107页 |
| 2.6.1 新型EML4-ALK融合基因参考物质均一性验证 | 第105-106页 |
| 2.6.2 新型EML4-ALK融合基因参考物质稳定性验证 | 第106-107页 |
| 3. 讨论 | 第107-110页 |
| 参考文献 | 第110-115页 |
| 论文综述 | 第115-140页 |
| References | 第133-140页 |
| 附录 | 第140-181页 |
| 附录1 PX330载体信息 | 第140-146页 |
| 1. pX330载体结构 | 第140页 |
| 2. pX330载体位点 | 第140-141页 |
| 3. pX330载体序列 | 第141-146页 |
| 附录2 PEGFP-1载体信息 | 第146-150页 |
| 1. pEGFP-1载体结构 | 第146页 |
| 2. pEGFP-1载体位点 | 第146-147页 |
| 3. pEGFP-1载体序列 | 第147-150页 |
| 附录3 PMD18-T载体信息 | 第150-153页 |
| 1. pMD18-T载体结构 | 第150页 |
| 2. pMD18-T载体位点 | 第150页 |
| 3. pMD18-T载体序列 | 第150-153页 |
| 附录4 EML4-ALK融合基因V1型、V2型及V3型MRNA序列信息 | 第153-161页 |
| 1. EML4-ALK融合基因V1型mRNA序列信息 | 第153-155页 |
| 2. EML4-ALK融合基因V2型mRNA序列信息 | 第155-157页 |
| 3. EML4-ALK融合基因V3a型mRNA序列信息 | 第157-158页 |
| 4. EML4-ALK融合基因V3b型mRNA序列信息 | 第158-161页 |
| 附录5 EML4基因及ALK基因MRNA序列信息 | 第161-168页 |
| 1. EML4基因mRNA序列信息 | 第161-163页 |
| 2. ALK基因mRNA序列信息 | 第163-168页 |
| 附录6 EML4基因INTRON 13/INTRON 20/INTRON 6及ALK基因INTRON 19序列信息 | 第168-181页 |
| 1. EML4基因intron 13序列信息 | 第168-170页 |
| 2. EML4基因intron 20序列信息 | 第170-171页 |
| 3. EML4基因intron 6序列信息 | 第171-179页 |
| 4. ALK基因intron 19序列信息 | 第179-181页 |
| 致谢 | 第181-183页 |
| 个人简介 | 第183-184页 |
