| 摘要 | 第3-6页 |
| ABSTRACT | 第6-9页 |
| 第一章 前言 | 第14-28页 |
| 1.1 概述 | 第14-15页 |
| 1.1.1 饮酒现状及危害 | 第14页 |
| 1.1.2 酒精的代谢机理 | 第14-15页 |
| 1.2 解酒药物的研究现状 | 第15-18页 |
| 1.2.1 解酒药物的作用机理 | 第15-16页 |
| 1.2.2 常见的解酒药物 | 第16-18页 |
| 1.3 乙醛脱氢酶2的相关研究 | 第18-20页 |
| 1.3.1 乙醛脱氢酶2基因的多态性 | 第18-19页 |
| 1.3.2 乙醛脱氢酶2及相关疾病 | 第19-20页 |
| 1.3.3 乙醛脱氢酶的提取方法 | 第20页 |
| 1.4 重组蛋白技术 | 第20-27页 |
| 1.4.1 构建重组质粒 | 第21-23页 |
| 1.4.2 诱导表达重组蛋白 | 第23-24页 |
| 1.4.3 亲和层析法纯化重组蛋白 | 第24-25页 |
| 1.4.4 包涵体概述 | 第25-27页 |
| 1.5 研究目的及意义 | 第27-28页 |
| 第二章 突变型乙醛脱氢酶2(E487K)的分子克隆 | 第28-43页 |
| 2.1 前言 | 第28页 |
| 2.2 实验材料和方法 | 第28-38页 |
| 2.2.1 菌株及质粒 | 第28页 |
| 2.2.2 试剂 | 第28-29页 |
| 2.2.3 实验仪器和设备 | 第29-30页 |
| 2.2.4 实验前准备 | 第30页 |
| 2.2.5 引物的设计与合成 | 第30页 |
| 2.2.6 总RNA提取 | 第30-31页 |
| 2.2.7 反转录 | 第31-32页 |
| 2.2.8 PCR扩增Aldh2(E487K)基因 | 第32页 |
| 2.2.9 PCR产物的回收纯化 | 第32-33页 |
| 2.2.10 重组克隆质粒pMD19-T-ALDH2(E487K)的构建 | 第33-34页 |
| 2.2.11 转化 | 第34-35页 |
| 2.2.12 抽提阳性质粒 | 第35-36页 |
| 2.2.13 双酶切获取目的基因片段 | 第36页 |
| 2.2.14 双酶切获取pET44b(+)线性化质粒 | 第36-37页 |
| 2.2.15 重组表达质粒pET44b-ALDH2(E487K)的构建 | 第37-38页 |
| 2.3 实验结果和讨论 | 第38-42页 |
| 2.3.1 目的基因PCR扩增结果 | 第38页 |
| 2.3.2 TA克隆及双酶切鉴定 | 第38-39页 |
| 2.3.3 测序及序列同源对比分析 | 第39-41页 |
| 2.3.4 重组表达质粒pET44b-ALDH2(E487K)的构建及鉴定 | 第41-42页 |
| 2.4 本章小结 | 第42-43页 |
| 第三章 ALDH2(E487K)的蛋白表达及条件优化 | 第43-52页 |
| 3.1 前言 | 第43页 |
| 3.2 实验材料和方法 | 第43-48页 |
| 3.2.1 实验材料 | 第43-44页 |
| 3.2.2 主要仪器和设备 | 第44页 |
| 3.2.3 小量诱导重组蛋白表达 | 第44-45页 |
| 3.2.4 SDS-PAGE电泳 | 第45-46页 |
| 3.2.5 表达条件的优化 | 第46页 |
| 3.2.6 IOD分析 | 第46-47页 |
| 3.2.7 重组蛋白鉴定 | 第47-48页 |
| 3.3 实验结果和讨论 | 第48-51页 |
| 3.3.1 重组蛋白ALDH2(E487K)的表达条件优化 | 第48-51页 |
| 3.3.2 重组蛋白表达产物的鉴定 | 第51页 |
| 3.4 本章小结 | 第51-52页 |
| 第四章 重组蛋白ALDH2(E487K)蛋白复性及纯化 | 第52-58页 |
| 4.1 前言 | 第52页 |
| 4.2 实验材料和方法 | 第52-55页 |
| 4.2.1 主要试剂 | 第52页 |
| 4.2.2 主要溶剂配制 | 第52-53页 |
| 4.2.3 主要仪器和设备 | 第53页 |
| 4.2.4 包涵体大量制备 | 第53页 |
| 4.2.5 重组菌包涵体蛋白ALDH2(E487K)的洗涤溶解及柱上复性 | 第53-54页 |
| 4.2.6 蛋白浓度测定 | 第54-55页 |
| 4.3 实验结果和讨论 | 第55-57页 |
| 4.3.1 ALDH2(E487K)柱上复性条件优化 | 第55-56页 |
| 4.3.2 ALDH2(E487K)蛋白浓度测定 | 第56-57页 |
| 4.4 本章小结 | 第57-58页 |
| 第五章 突变型乙醛脱氢酶2酶活力及稳定性研究 | 第58-68页 |
| 5.1 前言 | 第58页 |
| 5.2 实验材料和方法 | 第58-61页 |
| 5.2.1 主要材料 | 第58页 |
| 5.2.2 主要仪器 | 第58页 |
| 5.2.3 ALDH2蛋白的稀释 | 第58页 |
| 5.2.4 酶活分析 | 第58-59页 |
| 5.2.5 ALDH2(E487K)催化反应的最适条件测定 | 第59-61页 |
| 5.2.6 ALDH2(E487K)的热稳定性及酸碱稳定性分析 | 第61页 |
| 5.3 实验结果和讨论 | 第61-67页 |
| 5.3.1 蛋白浓度的稀释 | 第61页 |
| 5.3.2 酶活性分析 | 第61-62页 |
| 5.3.3 ALDH2(E487K)催化反应的最适反应温度及最适反应pH | 第62-65页 |
| 5.3.4 ALDH2(E487K)的热稳定性及酸碱稳定性分析 | 第65-67页 |
| 5.4 本章小结 | 第67-68页 |
| 第六章 总结与展望 | 第68-71页 |
| 6.1 总结 | 第68-69页 |
| 6.2 创新点 | 第69页 |
| 6.3 展望 | 第69-71页 |
| 参考文献 | 第71-81页 |
| 致谢 | 第81-82页 |
