| 摘要 | 第5-6页 |
| ABSTRACT | 第6页 |
| 缩写词与符号 | 第7-11页 |
| 第一部分 文献综述 | 第11-22页 |
| 1 丁香假单胞菌 | 第11-14页 |
| 1.1 丁香假单胞菌生物学特征 | 第11页 |
| 1.2 丁香假单胞菌磷脂酰胆碱(PC)合成途径 | 第11-13页 |
| 1.3 PC缺失影响丁香假单胞菌毒力 | 第13-14页 |
| 2 细菌的分泌系统 | 第14-20页 |
| 2.1 细菌Ⅰ型分泌系统 | 第15-18页 |
| 2.1.1 Ⅰ型分泌系统的组成 | 第15-17页 |
| 2.1.2 T1SS的分泌途径和机制 | 第17-18页 |
| 2.1.3 丁香假单胞菌中的T1SS | 第18页 |
| 2.2 细菌Ⅲ型分泌系统 | 第18-20页 |
| 2.2.1 Ⅲ型分泌系统简介 | 第18-19页 |
| 2.2.2 Ⅲ型分泌系统的核心结构 | 第19-20页 |
| 2.2.3 丁香假单胞菌中的T3SS | 第20页 |
| 3 研究内容、目的和意义 | 第20-22页 |
| 第二部分 磷脂酰胆碱对丁香假单胞菌1336 T1SS、T3SS-相关基因转录的影响 | 第22-41页 |
| 1 实验仪器、材料与试剂 | 第22-28页 |
| 1.1 主要仪器设备 | 第22页 |
| 1.2 实验所需菌株和引物 | 第22-27页 |
| 1.3 主要试剂 | 第27页 |
| 1.4 培养基配制 | 第27页 |
| 1.5 主要溶液及其配制 | 第27-28页 |
| 1.5.1 0.1%(Ⅴ/Ⅴ) DEPC水的配制 | 第27页 |
| 1.5.2 RNase-free水的制备 | 第27页 |
| 1.5.3 DNA电泳缓冲液 | 第27-28页 |
| 1.5.4 诱导表达相关试剂 | 第28页 |
| 2 实验方法 | 第28-30页 |
| 2.1 细菌的培养 | 第28页 |
| 2.2 RNA抽提(Trizol法) | 第28-29页 |
| 2.3 RT-PCR | 第29-30页 |
| 3 实验结果 | 第30-41页 |
| 3.1 丁香假单胞菌1336野生型和pcs~-突变型RNA制备结果 | 第30页 |
| 3.2 T1SS相关基因野生型和pcs~-突变型中表达比较 | 第30-34页 |
| 3.3 T3SS相关基因野生型和pcs~-突变型中表达比较 | 第34-41页 |
| 总结与展望 | 第41-42页 |
| 参考文献 | 第42-50页 |
| 附录 CFG、GBP蛋白在细菌中的可溶性表达及纯化 | 第50-71页 |
| 1 实验仪器、材料与试剂 | 第50-53页 |
| 1.1 主要仪器设备 | 第50页 |
| 1.2 菌株、载体和引物 | 第50-51页 |
| 1.3 主要试剂与溶液配制 | 第51-53页 |
| 1.3.1 试验所需培养基配制 | 第51页 |
| 1.3.2 DNA电泳相关试剂 | 第51-52页 |
| 1.3.3 蛋白质诱导表达所需相关试剂 | 第52页 |
| 1.3.4 SDS-PAGE胶所需溶液及胶的配制 | 第52页 |
| 1.3.5 目的蛋白纯化所需相关试剂 | 第52-53页 |
| 1.3.6 透析袋的处理 | 第53页 |
| 2 实验方法 | 第53-61页 |
| 2.1 菌株培养 | 第53-54页 |
| 2.2 CFG、GBP基因的克隆 | 第54-56页 |
| 2.2.1 质粒DNA的小量抽提 | 第54页 |
| 2.2.2 CFG、GBP基因PCR扩增 | 第54-55页 |
| 2.2.3 PCR产物回收 | 第55页 |
| 2.2.4 PCR产物与载体连接 | 第55-56页 |
| 2.3 构建重组表达载体 | 第56-57页 |
| 2.3.1 构建pGEX-6p-1-CFG重组表达载体 | 第56页 |
| 2.3.2 pET-28a-GBP表达载体的构建 | 第56-57页 |
| 2.4 CFG、GBP在大肠杆菌中的诱导表达 | 第57-58页 |
| 2.5 蛋白的纯化方法 | 第58-61页 |
| 2.5.1 His融合蛋白的纯化 | 第58-60页 |
| 2.5.1.1 琼脂糖凝胶装柱 | 第58页 |
| 2.5.1.2 金属离子的螫合 | 第58页 |
| 2.5.1.3 层析柱的平衡 | 第58-59页 |
| 2.5.1.4 上样 | 第59页 |
| 2.5.1.5 洗柱 | 第59页 |
| 2.5.1.6 洗脱 | 第59-60页 |
| 2.5.2 含有GST标签的融合蛋白的纯化 | 第60-61页 |
| 2.5.2.1 装柱 | 第60页 |
| 2.5.2.2 平衡 | 第60页 |
| 2.5.2.3 上样 | 第60页 |
| 2.5.2.4 洗脱 | 第60-61页 |
| 3 实验结果 | 第61-71页 |
| 3.1 重组表达质粒的构建 | 第61-67页 |
| 3.1.1 pGEX-6p-1-CFG重组质粒的构建 | 第61-64页 |
| 3.1.2 pET-28a-GBP重组质粒的构建 | 第64-67页 |
| 3.2 目的蛋白的表达与纯化 | 第67-71页 |
| 3.2.1 CFG基因在大肠杆菌Transata中的表达及纯化 | 第67-68页 |
| 3.2.2 GBP基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达与纯化 | 第68-71页 |
| 致谢 | 第71页 |
