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重组表达Exendin-4功能肽乳酸菌工程菌的构建及口服投递活性研究

摘要第4-5页
Abstract第5-6页
缩略词表第7-12页
第一章 绪论第12-32页
    1.1 糖尿病第12-20页
        1.1.1 糖尿病概述第12-13页
        1.1.2 Ⅱ型糖尿病的治疗策略及药物第13-15页
        1.1.3 胰高血糖素样肽-1(GLP-1)第15-18页
        1.1.4 GLP-1的相关药物研究现状第18-20页
    1.2 乳酸菌对Ⅱ型糖尿病的影响第20-24页
        1.2.1 乳酸菌简介第20-21页
        1.2.2 肠道菌群改变与糖尿病发生的关系第21页
        1.2.3 乳酸菌对糖尿病的作用第21-23页
        1.2.4 乳酸菌调控糖尿病的可能机制第23-24页
    1.3 乳酸菌作为功能因子投递载体的研究概况第24-29页
        1.3.1 乳酸菌作为功能因子投递载体的优势第24-25页
        1.3.2 乳酸菌的表达系统第25-27页
        1.3.3 乳酸菌作为粘膜投递载体的研究进展第27-29页
    1.4 立题依据及意义第29-30页
    1.5 研究内容及技术路线第30-32页
        1.5.1 研究内容第30-31页
        1.5.2 技术路线第31-32页
第二章 重组的乳酸乳球菌分泌表达Exendin-4第32-49页
    2.1 引言第32页
    2.2 材料与试剂第32-35页
        2.2.1 使用菌株及质粒第32-33页
        2.2.2 菌株培养方法第33页
        2.2.3 主要试剂及溶液配制第33-35页
        2.2.4 主要仪器设备第35页
    2.3 实验方法第35-39页
        2.3.1 L.lactococcus NZ9000感受态制备及转化第35-36页
        2.3.2 Exendin-4基因的克隆及表达第36-37页
        2.3.3 Western blot检测重组蛋白表达第37-38页
        2.3.4 大鼠胰岛细胞系INS-1的培养第38页
        2.3.5 促胰岛素分泌实验第38页
        2.3.6 促胰岛细胞增殖实验第38-39页
        2.3.7 促胰岛细胞凋亡实验第39页
        2.3.8 AKT和p-AKT蛋白表达的检测第39页
        2.3.9 实验数据分析第39页
    2.4 结果分析第39-47页
        2.4.1 Exendin-4表达载体的构建及转化第39-41页
        2.4.2 Western blot检测胞内外蛋白表达第41页
        2.4.3 ELISA检测nisin诱导不同时间胞外蛋白的分泌量第41-42页
        2.4.4 Nisin诱导重组菌株1h后重组菌株持续表达分泌Exendin-4的能力第42-43页
        2.4.5 rExd4促进胰岛细胞系INS-1分泌胰岛素第43-44页
        2.4.6 rExd4促进胰岛细胞增殖第44-45页
        2.4.7 rExd4抑制胰岛细胞凋亡第45-46页
        2.4.8 rExd4上调胰岛细胞AKT和p-AKT蛋白的表达第46-47页
    2.5 讨论第47-48页
    2.6 小结第48-49页
第三章 具有降血糖益生作用的乳杆菌的筛选第49-64页
    3.1 引言第49-50页
    3.2 材料与试剂第50-51页
        3.2.1 菌株第50页
        3.2.2 菌株培养方法第50页
        3.2.3 主要试剂及溶液配置第50-51页
        3.2.4 主要仪器设备第51页
    3.3 实验方法第51-55页
        3.3.1 乳酸菌上清(CFS)的制备第51页
        3.3.2 乳酸菌胞内提取物(CFE)的制备第51-52页
        3.3.3 DPP-Ⅳ抑制活性的分析第52-53页
        3.3.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性的分析第53-54页
        3.3.5 乳酸菌在人工模拟的胃肠液中的存活率第54页
        3.3.6 乳酸菌对HT-29细胞的黏附性分析第54页
        3.3.7 实验数据分析第54-55页
    3.4 结果与分析第55-63页
        3.4.1 乳酸菌对DPP-Ⅳ的抑制率第55-58页
        3.4.2 乳酸菌在不同生长阶段分泌的CFS的DPP-Ⅳ抑制率第58页
        3.4.3 温度、酸碱处理及酶处理对乳酸菌上清DPP-Ⅳ抑制活性的影响第58-60页
        3.4.4 乳酸菌对猪小肠提取的α-葡萄糖苷酶的抑制率第60-62页
        3.4.5 乳酸菌对人工模拟的胃肠液的耐受能力及对肠上皮细胞HT-29的黏附能力第62-63页
    3.5 本章小结第63-64页
第四章 L. paracasei L14分泌表达具有生物活性的Exendin-4第64-82页
    4.1 引言第64页
    4.2 材料与试剂第64-67页
        4.2.1 实验菌株及质粒第64-65页
        4.2.2 菌株培养方法第65页
        4.2.3 主要试剂及溶液配制第65-66页
        4.2.4 主要仪器设备第66-67页
    4.3 实验方法第67-70页
        4.3.1 副干酪乳杆菌L.paracasei L14感受态制备及转化第67-68页
        4.3.2 Exendin-4基因的克隆及电激转化入L.paracasei L14第68页
        4.3.3 Exendin-4基因在L.paracasei L14/pMG76e-Exendin-4中的异源表达和分泌第68页
        4.3.4 大鼠胰岛素瘤细胞系INS-1的培养方法第68页
        4.3.5 促胰岛素分泌实验及胰岛细胞RNA提取第68-69页
        4.3.6 促胰岛细胞增殖实验第69-70页
        4.3.7 促胰岛细胞凋亡实验第70页
        4.3.8 Caco-2细胞对重组菌株分泌的Exendin-4的转运吸收实验第70页
        4.3.9 试验数据分析第70页
    4.4 结果与分析第70-80页
        4.4.1 PCR扩增Exendin-4基因第70-71页
        4.4.2 Exendin-4表达载体的构建及电激转化第71-72页
        4.4.3 Western blot检测Exendin-4在L.paracasei L14中的重组表达第72-73页
        4.4.4 重组的Exendin-4促进胰岛细胞分泌胰岛素第73-74页
        4.4.5 重组的Exendin-4上调PDX-1和Insulin基因的mRNA表达第74-75页
        4.4.6 重组的Exendin-4促进胰岛细胞增殖和抑制胰岛细胞凋亡第75-78页
        4.4.7 Caco-2细胞对重组菌株分泌的Exendin-4的转运吸收实验第78-80页
    4.5 讨论第80-81页
    4.6 小结第81-82页
第五章 乳杆菌工程菌株投递Exendin-4的体内生物活性研究第82-105页
    5.1 引言第82页
    5.2 材料与试剂第82-85页
        5.2.1 试验菌株第82-83页
        5.2.2 试验动物与饲料第83-84页
        5.2.3 主要试剂第84页
        5.2.4 主要仪器设备第84-85页
    5.3 实验方法第85-88页
        5.3.1 乳酸菌的制备第85页
        5.3.2 动物饲养条件第85页
        5.3.3 动物分组及糖尿病模型建立第85-86页
        5.3.4 摄食量、饮水量和体重第86-87页
        5.3.5 血糖检测第87页
        5.3.6 口服糖耐量实验(OGTT)第87页
        5.3.7 大鼠的处死及样品的收集第87页
        5.3.8 脏器系数第87页
        5.3.9 糖尿病相关指标检测第87页
        5.3.10 炎症因子检测第87-88页
        5.3.11 肝匀浆液中抗氧化指标的检测第88页
        5.3.12 血清中血脂四项及游离脂肪酸的检测第88页
        5.3.13 胰腺和肝脏组织HE染色切片的制作第88页
        5.3.14 结肠组织免疫荧光检测第88页
        5.3.15 统计方法第88页
    5.4 结果与分析第88-103页
        5.4.1 大鼠肠道中Exendin-4的检测第88-90页
        5.4.2 Ⅱ型糖尿病大鼠模型的建立第90-96页
        5.4.3 乳酸菌对Ⅱ型糖尿病大鼠生化指标的影响第96-100页
        5.4.4 乳酸菌对Ⅱ型糖尿病大鼠肝脏和胰腺组织的影响第100-103页
    5.5 讨论第103-104页
    5.6 本章小结第104-105页
第六章 全文结论与展望第105-107页
    6.1 全文总结第105-106页
    6.2 论文创新点第106页
    6.3 展望第106-107页
参考文献第107-123页
附录第123-124页
致谢第124-126页
个人简介第126-127页
    发表论文情况第126-127页
    获奖情况第127页

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