| 摘要 | 第6-7页 |
| abstract | 第7页 |
| 英文缩略表 | 第12-13页 |
| 第一章 引言 | 第13-19页 |
| 1.1 PED的概述 | 第13-18页 |
| 1.1.1 病原学 | 第13-14页 |
| 1.1.2 基因组的结构 | 第14页 |
| 1.1.3 结构蛋白基因及其编码蛋白功能 | 第14-16页 |
| 1.1.4 流行病学 | 第16页 |
| 1.1.5 诊断 | 第16-17页 |
| 1.1.6 防制 | 第17-18页 |
| 1.2 研究的目的和意义 | 第18-19页 |
| 第二章 猪流行性腹泻病毒纯化及重组蛋白表达 | 第19-28页 |
| 2.1 材料 | 第19页 |
| 2.1.1 细胞、毒株、质粒 | 第19页 |
| 2.1.2 主要耗材及设备 | 第19页 |
| 2.2 方法 | 第19-23页 |
| 2.2.1 细胞培养 | 第19页 |
| 2.2.2 病毒繁殖 | 第19-20页 |
| 2.2.3 TCID50的测定 | 第20页 |
| 2.2.4 病毒纯化 | 第20页 |
| 2.2.5 病毒基因组的提取 | 第20页 |
| 2.2.6 PEDV全基因组反转录 | 第20-21页 |
| 2.2.7 PEDV核衣壳基因的扩增 | 第21页 |
| 2.2.8 pGEX-6P-1载体的扩增 | 第21-22页 |
| 2.2.9 重组质粒的构建 | 第22页 |
| 2.2.10 质粒的转化 | 第22页 |
| 2.2.11 N蛋白的表达与纯化 | 第22-23页 |
| 2.2.12 重组蛋白的SDS-PAGE分析 | 第23页 |
| 2.2.13 重组蛋白的Westernblot分析 | 第23页 |
| 2.3 结果 | 第23-27页 |
| 2.3.1 TCID50的测定 | 第23页 |
| 2.3.2 病毒纯化 | 第23-24页 |
| 2.3.3 N基因的扩增 | 第24-25页 |
| 2.3.4 质粒重组的鉴定 | 第25-26页 |
| 2.3.5 重组N蛋白纯化 | 第26页 |
| 2.3.6 重组N蛋白的SDS-PAGE分析 | 第26-27页 |
| 2.3.7 表达产物的Westernblot分析 | 第27页 |
| 2.4 讨论 | 第27-28页 |
| 第三章 单克隆抗体的制备 | 第28-38页 |
| 3.1 材料 | 第28页 |
| 3.1.1 细胞及实验动物 | 第28页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第28页 |
| 3.2 方法 | 第28-32页 |
| 3.2.1 免疫程序 | 第28-29页 |
| 3.2.2 饲养层的制备 | 第29页 |
| 3.2.3 骨髓瘤(SP2/0)细胞的准备 | 第29页 |
| 3.2.4 脾细胞的准备 | 第29页 |
| 3.2.5 骨髓瘤(SP2/0)细胞和脾细胞的融合 | 第29-30页 |
| 3.2.6 阳性杂交瘤细胞的筛选与克隆 | 第30页 |
| 3.2.7 间接ELISA的建立 | 第30页 |
| 3.2.8 阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆纯化 | 第30页 |
| 3.2.9 杂交瘤细胞的保存 | 第30页 |
| 3.2.10 腹水制备及效价测定 | 第30-31页 |
| 3.2.11 Westernblot鉴定 | 第31页 |
| 3.2.12 IFA试验 | 第31页 |
| 3.2.13 MAb结合表位分析 | 第31页 |
| 3.2.14 MAb相对亲和力的分析 | 第31-32页 |
| 3.3 结果 | 第32-37页 |
| 3.3.1 小鼠血清效价的监测 | 第32页 |
| 3.3.2 间接ELISA检测方法的建立 | 第32页 |
| 3.3.3 杂交瘤细胞株的建立 | 第32页 |
| 3.3.4 MAbs抗体效价的测定 | 第32-34页 |
| 3.3.5 Westernblot鉴定 | 第34-35页 |
| 3.3.6 IFA鉴定 | 第35-36页 |
| 3.3.7 MAb结合表位分析 | 第36-37页 |
| 3.3.8 MAb相对亲和力测定结果 | 第37页 |
| 3.4 讨论 | 第37-38页 |
| 第四章 双抗体夹心ELISA方法的建立及优化 | 第38-45页 |
| 4.1 材料 | 第38页 |
| 4.1.1 主要实验耗材及设备 | 第38页 |
| 4.1.2 肠内容物和血清 | 第38页 |
| 4.2 方法 | 第38-40页 |
| 4.2.1 待测样品的制备 | 第38页 |
| 4.2.2 抗体纯化 | 第38-39页 |
| 4.2.3 ELISA基本操作方法 | 第39页 |
| 4.2.4 MAb包被浓度与猪PEDV阳性多抗稀释度的确定 | 第39页 |
| 4.2.5 最佳封闭液浓度及时间的确定 | 第39页 |
| 4.2.6 HRP标记抗猪IgG(H+L)二抗浓度及作用时间的确定 | 第39页 |
| 4.2.7 显色剂显色时间的确定 | 第39页 |
| 4.2.8 特异性实验 | 第39-40页 |
| 4.2.9 灵敏性实验 | 第40页 |
| 4.2.10 重复性实验 | 第40页 |
| 4.2.11 临床样品RT-PCR检测 | 第40页 |
| 4.3 结果 | 第40-43页 |
| 4.3.1 抗体纯化 | 第40-41页 |
| 4.3.2 MAb包被浓度与猪阳性多抗稀释度的确定 | 第41页 |
| 4.3.3 ELISA判断标准的确定 | 第41页 |
| 4.3.4 封闭液浓度和封闭时间的确定 | 第41-42页 |
| 4.3.5 HRP标记抗猪IgG(H+L)二抗浓度及作用时间 | 第42页 |
| 4.3.6 显色剂显色时间确定 | 第42页 |
| 4.3.7 特异性实验 | 第42页 |
| 4.3.8 灵敏度实验 | 第42-43页 |
| 4.3.9 重复性实验 | 第43页 |
| 4.3.10 临床样品检测 | 第43页 |
| 4.4 讨论 | 第43-45页 |
| 第五章 全文结论 | 第45-46页 |
| 参考文献 | 第46-53页 |
| 致谢 | 第53-54页 |
| 作者简历 | 第54页 |
