| 中文摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一部分 文献综述 | 第13-21页 |
| 1 西氏贝蛔虫病概述 | 第13-14页 |
| 1.1 西氏贝蛔虫 | 第13页 |
| 1.2 流行病学 | 第13-14页 |
| 1.3 大熊猫西氏贝蛔虫病诊断 | 第14页 |
| 2 三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH) | 第14-18页 |
| 2.1 三磷酸甘油醛醛脱氢酶的分子结构 | 第14-15页 |
| 2.2 三磷酸甘油醛醛脱氢酶的功能 | 第15-16页 |
| 2.2.1 蛋白磷酸转移酶的分子伴侣 | 第15页 |
| 2.2.2 细胞的修复和转录 | 第15-16页 |
| 2.2.3 参与细胞凋亡 | 第16页 |
| 2.2.4 其他功能 | 第16页 |
| 2.3 寄生虫的三磷酸甘油醛脱氢酶 | 第16-18页 |
| 2.3.1 疫苗候选分子 | 第16-17页 |
| 2.3.2 诊断候选抗原 | 第17页 |
| 2.3.3 药物靶标 | 第17-18页 |
| 3 硫氧还蛋白过氧化物酶 | 第18-20页 |
| 3.1 活性氧(reactive oxygen species,ROS)和硫氧还蛋白过氧化物酶(thioredoxin peroxidase,TPx)的概述 | 第18页 |
| 3.2 硫氧还蛋白过氧化物酶的作用机制 | 第18-19页 |
| 3.3 硫氧还蛋白过氧化物酶的功能 | 第19-20页 |
| 3.3.1 大分子物质的保护作用 | 第19页 |
| 3.3.2 参与细胞凋亡和信号转导 | 第19页 |
| 3.3.3 其他功能 | 第19-20页 |
| 3.4 寄生虫的硫氧还蛋白过氧化物酶 | 第20页 |
| 4 试验目的和意义 | 第20-21页 |
| 第二部分 研究内容 | 第21-75页 |
| 第一章 西氏贝蛔虫三磷酸甘油醛脱氢酶的特征分析与重组蛋白诊断价值的评估 | 第21-54页 |
| 1. 材料与试剂 | 第22-25页 |
| 1.1 试验动物 | 第22页 |
| 1.2 虫体、血清和二抗 | 第22页 |
| 1.3 主要试剂 | 第22页 |
| 1.4 质粒载体和菌株 | 第22-23页 |
| 1.5 主要仪器 | 第23页 |
| 1.6 常用缓冲溶液和培养基的配制 | 第23-24页 |
| 1.7 主要生物信息数据库和计算机软件 | 第24-25页 |
| 2. 方法 | 第25-35页 |
| 2.1 西氏贝蛔虫总RNA的提取 | 第25页 |
| 2.2 第一链cDNA的合成 | 第25页 |
| 2.3 Bs-GAPDH基因的获得 | 第25-26页 |
| 2.4 GAPDH基因PCR扩增产物的回收 | 第26页 |
| 2.5 PET-32α-GAPDH重组质粒的构建 | 第26-28页 |
| 2.5.1 GAPDH基因克隆测序 | 第26-27页 |
| 2.5.2 基因序列比对及生物信息学分析 | 第27页 |
| 2.5.3 质粒提取 | 第27-28页 |
| 2.5.4 质粒酶切回收 | 第28页 |
| 2.5.5 目的片段连接表达载体 | 第28页 |
| 2.5.6 重组质粒的双酶切鉴定 | 第28页 |
| 2.6 重组Bs-GAPDH的原核诱导表达 | 第28-30页 |
| 2.6.1 重组蛋白的诱导表达 | 第28-29页 |
| 2.6.2 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第29页 |
| 2.6.3 重组pET32a(+)-Bs-GAPDH表达条件的优化 | 第29-30页 |
| 2.6.4 重组蛋白pET32a(+)-Bs-GAPDH的可溶性分析 | 第30页 |
| 2.7 重组蛋白的纯化 | 第30-31页 |
| 2.8 重组蛋白免疫原性分析 | 第31-32页 |
| 2.8.1 兔抗Bs-GAPDH重组蛋白高免血清的制备 | 第31页 |
| 2.8.2 高免血清的纯化 | 第31-32页 |
| 2.8.3 重组蛋白的免疫印迹 | 第32页 |
| 2.9 免疫荧光定位 | 第32-33页 |
| 2.9.1 虫体腊块的制作 | 第32页 |
| 2.9.2 间接免疫荧光定位 | 第32-33页 |
| 2.10 间接ELISA方法的建立 | 第33-35页 |
| 2.10.1 感染性西氏贝蛔虫虫卵的培养 | 第33页 |
| 2.10.2 小鼠感染西氏贝蛔虫效价的测定 | 第33页 |
| 2.10.3 最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释倍数的确定 | 第33-34页 |
| 2.10.4 封闭液的确定 | 第34页 |
| 2.10.5 二抗稀释倍数的确定 | 第34页 |
| 2.10.6 重组蛋白间接ELISA程序的确定 | 第34页 |
| 2.10.7 间接ELISA临界值的确定 | 第34页 |
| 2.10.8 重复性检测 | 第34-35页 |
| 2.10.9 敏感性检测 | 第35页 |
| 2.10.10 特异性检测 | 第35页 |
| 3 结果 | 第35-51页 |
| 3.1 Bs-GAPDH基因的扩增 | 第35-36页 |
| 3.2 西氏贝蛔虫GAPDH基因的生物信息学分析 | 第36-41页 |
| 3.2.1 GAPDH基因的序列分析 | 第36页 |
| 3.2.2 GAPDH的氨基酸组分分析 | 第36-37页 |
| 3.2.3 GAPDH信号肽及跨膜区预测 | 第37-38页 |
| 3.2.4 GAPDH亲/疏水性分析 | 第38页 |
| 3.2.5 GAPDH亚细胞定位及抗原表位预测 | 第38-39页 |
| 3.2.6 GAPDH蛋白的氨基酸序列同源性分析及分子进化树的构建 | 第39-40页 |
| 3.2.7 GAPDH二级结构的预测 | 第40-41页 |
| 3.3 表达载体的构建 | 第41-42页 |
| 3.3.1 重组质粒的双酶切鉴定 | 第41页 |
| 3.3.2 重组pET32a(+)-Bs-GAPDH质粒的鉴定 | 第41-42页 |
| 3.4 重组质粒的表达 | 第42页 |
| 3.5 诱导表达条件的优化 | 第42-44页 |
| 3.5.1 IPTG浓度的优化 | 第42-44页 |
| 3.5.2 诱导时间的优化 | 第44页 |
| 3.5.3 诱导温度的优化 | 第44页 |
| 3.5.4 重组蛋白的可溶性分析与纯化 | 第44页 |
| 3.6 重组蛋白的免疫原性分析 | 第44-46页 |
| 3.6.1 兔抗Bs-GAPDH蛋白高免血清的制备 | 第44-45页 |
| 3.6.2 重组蛋白的免疫原性分析 | 第45-46页 |
| 3.7 GAPDH蛋白的免疫荧光定位 | 第46页 |
| 3.8 间接ELISA | 第46-51页 |
| 3.8.1 间接ELISA最佳抗原与血清最佳工作浓度的确定 | 第46-47页 |
| 3.8.2 小鼠感染西氏贝蛔虫效价的测定 | 第47-48页 |
| 3.8.3 间接ELISA最佳封闭液的确定 | 第48页 |
| 3.8.4 间接ELISA最佳二抗稀释度的确定 | 第48页 |
| 3.8.5 重组蛋白间接ELISA程序的确定 | 第48-49页 |
| 3.8.6 间接ELISA方法临界值的确定 | 第49页 |
| 3.8.7 间接ELISA方法的重复性 | 第49页 |
| 3.8.8 间接ELISA方法的敏感性检测 | 第49-50页 |
| 3.8.9 间接ELISA方法的特异性检测 | 第50-51页 |
| 4. 讨论 | 第51-54页 |
| 4.1 Bs-GAPDH的分子特征 | 第51页 |
| 4.2 Bs-GAPDH的免疫原性及蛋白定位分析 | 第51-52页 |
| 4.3 西氏贝蛔虫三磷酸甘油醛脱氢酶间接ELISA | 第52-54页 |
| 第二章 西氏贝蛔虫硫氧还蛋白过氧化物酶的特征分析及重组蛋白诊断价值的评估 | 第54-75页 |
| 1. 材料与方法 | 第55页 |
| 1.1 试验动物 | 第55页 |
| 1.2 虫体、血清和二抗 | 第55页 |
| 1.3 主要试剂 | 第55页 |
| 1.4 质粒载体和菌株 | 第55页 |
| 1.5 主要仪器 | 第55页 |
| 1.6 常用缓冲溶液和培养基的配制 | 第55页 |
| 1.7 主要生物信息数据库和计算机软件 | 第55页 |
| 2 试验方法 | 第55-57页 |
| 2.1 西氏贝蛔虫总RNA的提取 | 第55页 |
| 2.2 第一链cDNA的合成 | 第55页 |
| 2.3 Bs-Tpx基因的获得 | 第55-56页 |
| 2.4 扩增产物的回收 | 第56页 |
| 2.5 重组质粒的构建 | 第56页 |
| 2.6 原核诱导表达 | 第56页 |
| 2.7 蛋白的纯化 | 第56页 |
| 2.8 重组蛋白免疫原性的分析 | 第56-57页 |
| 2.9 免疫荧光定位 | 第57页 |
| 2.10 ELISA方法的建立 | 第57页 |
| 3 结果 | 第57-72页 |
| 3.1 Bs-Tpx基因的扩增 | 第57页 |
| 3.2 西氏贝蛔虫Tpx基因的生物信息学分析 | 第57-62页 |
| 3.2.1 Tpx的氨基酸组分分析 | 第57-58页 |
| 3.2.2 Tpx信号肽及跨膜区预测 | 第58-59页 |
| 3.2.3 Tpx亲/疏水性分析 | 第59-60页 |
| 3.2.4 Tpx亚细胞定位及抗原表位预测 | 第60页 |
| 3.2.5 Tpx蛋白的氨基酸序列同源性分析及分子进化树的构建 | 第60-62页 |
| 3.2.6 Tpx二级结构的预测 | 第62页 |
| 3.3 表达载体的构建 | 第62-63页 |
| 3.3.1 重组质粒的双酶切鉴定 | 第62-63页 |
| 3.3.2 重组pET32a(+)-Bs-Tpx质粒的鉴定 | 第63页 |
| 3.4 重组质粒的表达 | 第63页 |
| 3.5 诱导表达条件的优化 | 第63-65页 |
| 3.5.1 IPTG浓度的优化 | 第63-65页 |
| 3.5.2 诱导时间的优化 | 第65页 |
| 3.5.3 诱导温度的优化 | 第65页 |
| 3.5.4 重组蛋白的可溶性分析与纯化 | 第65页 |
| 3.6 重组蛋白的免疫原性分析 | 第65-67页 |
| 3.6.1 兔抗Bs-GAPDH蛋白高免血清的制备 | 第65-66页 |
| 3.6.2 重组蛋白的免疫原性分析 | 第66-67页 |
| 3.7 GAPDH蛋白的免疫荧光定位 | 第67页 |
| 3.8 间接ELISA | 第67-72页 |
| 3.8.1 间接ELISA最佳抗原与血清最佳工作浓度的确定 | 第67-68页 |
| 3.8.2 小鼠感染西氏贝蛔虫效价的测定 | 第68-69页 |
| 3.8.3 间接ELISA最佳封闭液的确定 | 第69页 |
| 3.8.4 间接ELISA最佳二抗稀释度的确定 | 第69页 |
| 3.8.5 重组蛋白间接ELISA程序的确定 | 第69-70页 |
| 3.8.6 间接ELISA方法临界值的确定 | 第70页 |
| 3.8.7 间接ELISA方法的重复性 | 第70页 |
| 3.8.8 间接ELISA方法的敏感性栓测 | 第70-71页 |
| 3.8.9 间接ELISA方法的特异性检测 | 第71-72页 |
| 4 讨论 | 第72-75页 |
| 4.1 Bs-Tpx的分子特征 | 第72页 |
| 4.2 西氏贝蛔虫的免疫原性及蛋白定位分析 | 第72-73页 |
| 4.3 西氏贝蛔虫三磷酸甘油醛脱氢酶间接ELISA | 第73-75页 |
| 第三部分 结论与创新点 | 第75-76页 |
| 一、结论 | 第75页 |
| 二、创新点 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-88页 |
| 致谢 | 第88-89页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第89页 |
