| 摘要 | 第4-6页 |
| abstract | 第6-7页 |
| 第一章 绪论 | 第14-23页 |
| 1.1 灰葡萄孢概述 | 第14-15页 |
| 1.2 灰葡萄孢致病相关基因研究 | 第15-17页 |
| 1.2.1 破坏植物细胞壁的相关基因 | 第15-16页 |
| 1.2.2 信号转导途径基因 | 第16-17页 |
| 1.3 灰葡萄孢菌多药抗性基因的研究 | 第17-18页 |
| 1.4 丝状真菌中单羧酸转运蛋白基因的研究 | 第18-21页 |
| 1.4.1 第一类单羧酸转运蛋白基因 | 第20-21页 |
| 1.4.2 第二类单羧酸转运蛋白基因 | 第21页 |
| 1.5 选题意义 | 第21-23页 |
| 第二章 灰葡萄孢BcmctA基因敲除菌株的构建 | 第23-42页 |
| 2.1 前言 | 第23页 |
| 2.2 材料 | 第23-26页 |
| 2.2.1 菌株 | 第23页 |
| 2.2.2 试剂和仪器 | 第23-24页 |
| 2.2.3 抗生素和培养基 | 第24-26页 |
| 2.2.4 载体和引物 | 第26页 |
| 2.3 方法 | 第26-37页 |
| 2.3.1 入门载体pETHG‐MAD‐MAU的构建 | 第26-33页 |
| 2.3.1.1 提取灰葡萄孢菌B05.10 基因组DNA | 第26-27页 |
| 2.3.1.2 克隆BcmctA基因上下游片段 | 第27-28页 |
| 2.3.1.3 PCR产物凝胶电泳分离 | 第28-29页 |
| 2.3.1.4 切胶回收上下游片段 | 第29页 |
| 2.3.1.5 上下游片段的TA克隆 | 第29-31页 |
| 2.3.1.6 构建重组质粒pETHG‐MAD | 第31-32页 |
| 2.3.1.7 构建入门载体pETHG‐MAD‐MAU | 第32-33页 |
| 2.3.2 双元载体pCAMBIA‐Bar‐ΔmctA的构建 | 第33-35页 |
| 2.3.2.1 LR反应 | 第33-34页 |
| 2.3.2.2 双元载体pCAMBIA‐Bar‐ΔmctA转化农杆菌AGL‐1 | 第34-35页 |
| 2.3.3 根癌农杆菌介导的灰葡萄孢转化 | 第35-37页 |
| 2.3.3.1 灰葡萄孢菌和农杆菌的活化及培养 | 第35页 |
| 2.3.3.2 农杆菌AGL‐1 介导的灰葡萄孢转化 | 第35-36页 |
| 2.3.3.3 突变株的分离纯化及保种 | 第36-37页 |
| 2.3.4 灰葡萄孢BcmctA敲除突变株的初步鉴定 | 第37页 |
| 2.3.4.1 利用引物对HptF/HptR进行PCR鉴定 | 第37页 |
| 2.3.4.2 利用引物对mctF2/mctR2进行PCR鉴定 | 第37页 |
| 2.4 结果与分析 | 第37-41页 |
| 2.4.1 入门载体pETHG‐MAD‐MAU的构建 | 第37-40页 |
| 2.4.1.1 BcmctA基因上下游片段的克隆及回收 | 第37-38页 |
| 2.4.1.2 上下游片段的TA克隆 | 第38页 |
| 2.4.1.3 构建质粒pETHG‐MAD | 第38-40页 |
| 2.4.2 双元载体pCAMBIA‐Bar‐ΔmctA的构建 | 第40-41页 |
| 2.4.2.1 LR反应 | 第40页 |
| 2.4.2.2 双元载体pCAMBIA‐Bar‐ΔmctA的获得 | 第40-41页 |
| 2.4.3 根癌农杆菌介导的灰葡萄孢的转化 | 第41页 |
| 2.4.4 灰葡萄孢BcmctA敲除突变株的初步鉴定 | 第41页 |
| 2.5 小结 | 第41-42页 |
| 第三章 灰葡萄孢BcmctA基因互补菌株的构建及鉴定 | 第42-61页 |
| 3.1 前言 | 第42页 |
| 3.2 材料 | 第42-43页 |
| 3.2.1 供试菌株 | 第42页 |
| 3.2.2 载体及引物 | 第42-43页 |
| 3.2.3 主要试剂及试剂盒 | 第43页 |
| 3.3 方法 | 第43-56页 |
| 3.3.1 扩增BcmctA基因全序列 | 第43-44页 |
| 3.3.2 BcmctA基因的TA克隆 | 第44页 |
| 3.3.3 入门载体pETHG‐mctA的构建 | 第44-46页 |
| 3.3.4 双元载体的构建 | 第46页 |
| 3.3.5 互补菌株的构建及纯化 | 第46-47页 |
| 3.3.6 BcmctA敲除菌株及互补菌株的分子鉴定 | 第47-56页 |
| 3.3.6.1 PCR鉴定 | 第47-48页 |
| 3.3.6.2 Southern blot分析 | 第48-53页 |
| 3.3.6.3 RT‐PCR鉴定 | 第53-56页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第56-60页 |
| 3.4.1 扩增BcmctA基因全序列 | 第56页 |
| 3.4.2 BcmctA基因的TA克隆 | 第56页 |
| 3.4.3 构建入门载体pETHG‐mctA | 第56-57页 |
| 3.4.4 双元载体pCAMBIA‐mctA的构建 | 第57页 |
| 3.4.5 互补菌株的获得 | 第57页 |
| 3.4.6 BcmctA敲除菌株及互补菌株的分子鉴定 | 第57-60页 |
| 3.4.6.1 PCR鉴定 | 第57-58页 |
| 3.4.6.2 Southern blot分析 | 第58-59页 |
| 3.4.6.3 RT‐PCR鉴定 | 第59-60页 |
| 3.5 小结 | 第60-61页 |
| 第四章 突变株表型及功能分析 | 第61-71页 |
| 4.1 前言 | 第61页 |
| 4.2 材料 | 第61-62页 |
| 4.2.1 菌株与种子 | 第61页 |
| 4.2.2 试剂 | 第61页 |
| 4.2.3 培养基 | 第61-62页 |
| 4.3 方法 | 第62-65页 |
| 4.3.1 PDA平板上菌株的表型分析 | 第62-63页 |
| 4.3.1.1 PDA平板上生长速率的测定 | 第62页 |
| 4.3.1.2 PDA平板上孢子和菌核产率 | 第62-63页 |
| 4.3.2 MSC平板上的表型分析 | 第63-64页 |
| 4.3.2.1 MSC平板上生长速率的测定 | 第63页 |
| 4.3.2.2 菌丝中丙酮酸含量的测定 | 第63-64页 |
| 4.3.3 灰葡萄孢突变株致病性的研究 | 第64-65页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第65-70页 |
| 4.4.1 PDA平板上菌株的表型分析 | 第65-66页 |
| 4.4.1.1 PDA平板上生长速率测定 | 第65页 |
| 4.4.1.2 PDA平板上孢子和菌核产率 | 第65-66页 |
| 4.4.2 MSC平板上的表型分析 | 第66-68页 |
| 4.4.2.1 生长速率测定 | 第66-67页 |
| 4.4.2.2 菌丝中丙酮酸含量测定 | 第67-68页 |
| 4.4.3 致病性研究 | 第68-70页 |
| 4.5 小结 | 第70-71页 |
| 第五章 总结与展望 | 第71-73页 |
| 5.1 总结 | 第71-72页 |
| 5.2 展望 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-77页 |
| 致谢 | 第77-78页 |
| 在读期间发表的学术论文 | 第78页 |
