| 摘要 | 第5-8页 |
| ABSTRACT | 第8-11页 |
| 第1章 绪论 | 第15-24页 |
| 1.1 研究背景 | 第15-19页 |
| 1.1.1 磷脂酶简介 | 第15页 |
| 1.1.2 磷脂酶A1的主要来源及生理功能 | 第15-16页 |
| 1.1.3 磷脂酶A1的工业应用 | 第16-18页 |
| 1.1.5 磷脂酶A1的研究进展 | 第18-19页 |
| 1.2 融合标签表达系统简介 | 第19-21页 |
| 1.2.1 大肠杆菌表达系统 | 第19页 |
| 1.2.2 GST融合表达系统 | 第19-20页 |
| 1.2.3 His融合表达系统 | 第20页 |
| 1.2.4 MBP融合表达系统 | 第20页 |
| 1.2.5 其他融合表达系统 | 第20-21页 |
| 1.3 原核表达与纯化的概述 | 第21-23页 |
| 1.3.1 包涵体形成原因 | 第21页 |
| 1.3.2 重组蛋白可溶性表达策略 | 第21-22页 |
| 1.3.3 包涵体的变复性 | 第22页 |
| 1.3.4 融合蛋白的纯化 | 第22-23页 |
| 1.4 本课题的研究意义及内容 | 第23-24页 |
| 第2章 融合蛋白表达系统的构建 | 第24-37页 |
| 2.1 实验材料与仪器 | 第24-26页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第24页 |
| 2.1.2 酶类和生化试剂 | 第24-25页 |
| 2.1.3 培养基和溶液配制 | 第25页 |
| 2.1.4 DNA的合成与测序 | 第25页 |
| 2.1.5 仪器设备 | 第25-26页 |
| 2.2 实验方法 | 第26-31页 |
| 2.2.1 基因组DNA的提取 | 第26页 |
| 2.2.2 目的基因plaA的引物设计 | 第26-27页 |
| 2.2.3 目的基因plaA的扩增 | 第27-28页 |
| 2.2.4 pGEX-4T-2-A重组质粒的构建 | 第28-29页 |
| 2.2.5 E.coli感受态细胞的制备及连接产物的转化 | 第29-30页 |
| 2.2.6 转化子阳性克隆的鉴定 | 第30-31页 |
| 2.2.7 重组质粒的测序验证及菌株保藏 | 第31页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第31-36页 |
| 2.3.1 AP28质粒的提取 | 第31页 |
| 2.3.2 plaA基因的扩增 | 第31-32页 |
| 2.3.3 重组子的PCR和双酶切验证 | 第32-33页 |
| 2.3.4 测序结果分析 | 第33-34页 |
| 2.3.5 其他表达系统的构建 | 第34-35页 |
| 2.3.6 讨论与分析 | 第35-36页 |
| 2.5 本章小结 | 第36-37页 |
| 第3章 GST-A融合蛋白可溶性表达条件的摸索 | 第37-52页 |
| 3.1 实验材料与仪器 | 第37-40页 |
| 3.1.1 菌株 | 第37页 |
| 3.1.2 药品与仪器 | 第37-38页 |
| 3.1.3 培养基和试剂 | 第38-40页 |
| 3.2 试验方法 | 第40-43页 |
| 3.2.1 重组菌生长曲线与酶活的测定 | 第40页 |
| 3.2.2 GST-A融合蛋白的诱导表达 | 第40页 |
| 3.2.3 蛋白质样品的制备 | 第40-41页 |
| 3.2.4 GST-A融合蛋白的SDS-PAGE检测 | 第41-42页 |
| 3.2.5 GST-A融合蛋白可溶性表达的摸索 | 第42-43页 |
| 3.2.6 磷脂酶A1蛋白序列分析 | 第43页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第43-51页 |
| 3.3.1 重组菌的生长曲线与酶活 | 第43-44页 |
| 3.3.2 融合蛋白表达检测 | 第44-45页 |
| 3.3.3 融合蛋白可溶性表达条件分析 | 第45-49页 |
| 3.3.4 磷脂酶A1蛋白序列分析 | 第49-50页 |
| 3.3.5 讨论与分析 | 第50-51页 |
| 3.4 本章小结 | 第51-52页 |
| 第4章 His-GST-A融合蛋白的表达纯化 | 第52-66页 |
| 4.1 实验材料与仪器 | 第52-54页 |
| 4.1.1 菌株 | 第52页 |
| 4.1.2 药品与仪器 | 第52-53页 |
| 4.1.3 培养基和试剂 | 第53-54页 |
| 4.2 实验方法 | 第54-57页 |
| 4.2.1 His-GST-A表达系统的优化 | 第54页 |
| 4.2.2 菌体细胞(包涵体)的收集 | 第54页 |
| 4.2.3 包涵体的变复性 | 第54页 |
| 4.2.4 融合蛋白的纯化 | 第54-55页 |
| 4.2.5 磁珠的后处理与再生 | 第55-56页 |
| 4.2.6 蛋白质含量与酶活测定 | 第56页 |
| 4.2.7 His-GST-A酶学性质的研究 | 第56-57页 |
| 4.3 实验结果 | 第57-65页 |
| 4.3.1 表达条件优化分析 | 第57-59页 |
| 4.3.2 包涵体的变复性分析 | 第59-60页 |
| 4.3.3 融合蛋白的纯化 | 第60-61页 |
| 4.3.4 复性蛋白浓度与酶活测定 | 第61-62页 |
| 4.3.5 酶学性质分析 | 第62-64页 |
| 4.3.6 讨论与分析 | 第64-65页 |
| 4.4 本章小结 | 第65-66页 |
| 第5章 GST标签的切割与His-A蛋白样品的获得 | 第66-74页 |
| 5.1 实验材料与仪器 | 第66页 |
| 5.1.1 菌株 | 第66页 |
| 5.1.2 药品与仪器 | 第66页 |
| 5.1.3 培养基和试剂 | 第66页 |
| 5.2 实验方法 | 第66-69页 |
| 5.2.1 His-GST-A的变复性与纯化 | 第66页 |
| 5.2.2 His-GST-A酶活测定及其GST标签的切割 | 第66-68页 |
| 5.2.3 BL21/His-A表达系统的构建与表达 | 第68页 |
| 5.2.4 His-A蛋白的变复性及纯化 | 第68页 |
| 5.2.5 His-A蛋白液中咪唑的去除及其比酶活的计算 | 第68页 |
| 5.2.6 His-GST-A和His-A蛋白比酶活的比较 | 第68页 |
| 5.2.7 His-A蛋白干粉样品的获得 | 第68-69页 |
| 5.3 实验结果 | 第69-73页 |
| 5.3.1 His-GST-A蛋白的纯化与复性效率 | 第69页 |
| 5.3.2 GST标签的切割预实验 | 第69-70页 |
| 5.3.3 His-GST-A蛋白(去咪唑)比酶活的测定 | 第70页 |
| 5.3.4 His-GST-A蛋白(去咪唑)GST标签的切割 | 第70页 |
| 5.3.5 His-A重组质粒的构建与测序 | 第70-71页 |
| 5.3.6 His-A蛋白的表达与纯化 | 第71页 |
| 5.3.7 His-A蛋白(去咪唑)比酶活的测定 | 第71页 |
| 5.3.8 His-A蛋白干粉样品的获得 | 第71-72页 |
| 5.3.9 GST标签对PlaA蛋白酶活的影响 | 第72页 |
| 5.3.10 讨论与分析 | 第72-73页 |
| 5.4 本章小结 | 第73-74页 |
| 第6章 结论与展望 | 第74-76页 |
| 6.1 结论 | 第74-75页 |
| 6.2 展望 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-79页 |
| 攻读硕士期间发表论文 | 第79-80页 |
| 致谢 | 第80页 |
