| 摘要 | 第4-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 第一章 绪论 | 第15-19页 |
| 第二章 材料 | 第19-27页 |
| 2.1 实验仪器与设备 | 第19-20页 |
| 2.2 主要试剂与配制 | 第20-27页 |
| 2.2.1 常规试剂 | 第20-22页 |
| 2.2.2 质粒与菌株 | 第22页 |
| 2.2.3 细菌培养基 | 第22页 |
| 2.2.4 蛋白电泳缓冲系统 | 第22-23页 |
| 2.2.5 重组蛋白分离纯化溶液 | 第23页 |
| 2.2.6 质粒提取溶液配制 | 第23页 |
| 2.2.7 Western blot 相关试剂的配制 | 第23-24页 |
| 2.2.8 内毒素测定相关溶液及试剂 | 第24页 |
| 2.2.9 动物实验相关材料 | 第24-25页 |
| 2.2.10 流式细胞仪检测细胞周期相关试剂和材料 | 第25页 |
| 2.2.11 造血祖细胞集落培养相关试剂和溶液配制 | 第25-27页 |
| 第三章 方法 | 第27-55页 |
| 3.1 hMidkine 的克隆、表达、纯化与生物活性分析 | 第27-44页 |
| 3.1.1 感受态细胞制备(CaCl_2法) | 第27页 |
| 3.1.2 大肠杆菌转化 | 第27-28页 |
| 3.1.3 pET30a(＋)质粒抽提(碱裂解法) | 第28页 |
| 3.1.4 hMK PCR 引物设计 | 第28-29页 |
| 3.1.5 PCR 反应 | 第29-30页 |
| 3.1.6 DNA 琼脂糖凝胶电泳 | 第30-31页 |
| 3.1.7 PCR 产物割胶回收 | 第31-32页 |
| 3.1.8 hMK 片段与pTA2 vector 的连接 | 第32-33页 |
| 3.1.9 质粒酶切 | 第33-34页 |
| 3.1.10 目的基因片段和载体片段连接 | 第34页 |
| 3.1.11 连接产物转化大肠杆菌 | 第34页 |
| 3.1.12 双酶切检测目的基因和测序 | 第34-35页 |
| 3.1.13 pET30a(＋)-hMK 重组质粒转化BL21 菌株 | 第35页 |
| 3.1.14 hMK 诱导表达条件优化 | 第35页 |
| 3.1.15 hMK 的诱导表达 | 第35-36页 |
| 3.1.16 包涵体的分离和洗涤 | 第36页 |
| 3.1.17 包涵体的变性和复性 | 第36-37页 |
| 3.1.18 Sp-Sephorose 阳离子交换层析 | 第37-38页 |
| 3.1.19 Bradford 法测蛋白溶液浓度 | 第38页 |
| 3.1.20 蛋白样品SDS-PAGE | 第38-40页 |
| 3.1.21 Western blot 检测前述强离子交换柱纯化的蛋白的抗原性 | 第40-41页 |
| 3.1.22 SDS-PAGE 及银染法分析前述强离子交换柱纯化的人MK 重组蛋白的纯度 | 第41-43页 |
| 3.1.23 人MK 重组蛋白生物学活性测定 | 第43-44页 |
| 3.1.24 显色基质法测蛋白内毒素含量 | 第44页 |
| 3.2 phCMV 和mMidkine 质粒的制备 | 第44-48页 |
| 3.2.1 phCMV-mMK 的克隆 | 第44-46页 |
| 3.2.2 质粒大量抽提 | 第46-48页 |
| 3.2.3 用分光光度计测双链DNA 的浓度 | 第48页 |
| 3.3 动物实验 | 第48-55页 |
| 3.3.1 phCMV-mMK 质粒注射正常小鼠 | 第48-49页 |
| 3.3.2 外周血检测 | 第49页 |
| 3.3.3 骨髓细胞采集及计数 | 第49-50页 |
| 3.3.4 重组蛋白rhMK 注射正常小鼠 | 第50-51页 |
| 3.3.5 股骨切片及HE 染色 | 第51-53页 |
| 3.3.6 流式细胞仪检测骨髓单个核细胞周期 | 第53-54页 |
| 3.3.7 造血祖细胞集落培养 | 第54-55页 |
| 第四章 结果 | 第55-68页 |
| 4.1 hMK 的基因克隆及蛋白表达纯化结果 | 第55-64页 |
| 4.1.1 PCR 产物扩增结果 | 第55页 |
| 4.1.2 hMK-pTA2 酶切及测序结果 | 第55-56页 |
| 4.1.3 pET30a(+)-hMK 酶切鉴定结果 | 第56页 |
| 4.1.4 hMK 诱导条件的优化 | 第56-57页 |
| 4.1.5 hMK 重组菌诱导表达后包涵体的准备 | 第57-58页 |
| 4.1.6 包涵体的溶解及蛋白变性复性结果 | 第58页 |
| 4.1.7 hMK 过Sp-Sepharose 柱纯化结果 | 第58-59页 |
| 4.1.8 重组hMK 蛋白的SDS-PAGE 电泳鉴定 | 第59-60页 |
| 4.1.9 蛋白样品的透析 | 第60页 |
| 4.1.10 纯化得到的rhMK 蛋白纯度验证 | 第60-61页 |
| 4.1.11 Bradford 法测定重组蛋白的浓度 | 第61-62页 |
| 4.1.12 纯化过程中蛋白产量和得率的计算 | 第62页 |
| 4.1.13 Western blot 检测纯化得到的蛋白的抗原性 | 第62-63页 |
| 4.1.14 重组蛋白rhMK 活性测定结果 | 第63-64页 |
| 4.1.15 重组蛋白内毒素含量测定 | 第64页 |
| 4.2 动物实验结果 | 第64-68页 |
| 重组hMK 蛋白注射正常小鼠后对骨髓造血系统的作用 | 第64-68页 |
| 第五章 讨论 | 第68-71页 |
| 参考文献 | 第71-80页 |
| 文献综述 | 第80-93页 |
| 参考文献 | 第93-95页 |
| 致谢 | 第95-96页 |
| 硕士期间发表的论著 | 第96页 |
