| 文献综述 | 第11-26页 |
| 第一章 BAC研究进展 | 第11-20页 |
| 1.1 概述 | 第11页 |
| 1.2 BAC的发展史 | 第11-12页 |
| 1.3 BAC的应用 | 第12-19页 |
| 1.3.1 BAC文库的构建 | 第12页 |
| 1.3.2 基因组物理图谱的构建 | 第12-14页 |
| 1.3.3 基因的图位克隆 | 第14-16页 |
| 1.3.4 基因组测序 | 第16页 |
| 1.3.5 BAC转基因研究 | 第16-18页 |
| 1.3.6 BAC与比较基因组研究 | 第18-19页 |
| 1.3.7 BAC作为探针用于荧光原位杂交 | 第19页 |
| 1.4 展望 | 第19-20页 |
| 第二章 Red重组系统的研究进展 | 第20-26页 |
| 2.1 Red重组系统的组成 | 第20页 |
| 2.2 Red重组的机制 | 第20-22页 |
| 2.3 Red重组系统在遗传工程上的应用 | 第22-24页 |
| 2.4 Red重组系统对BAC的定位修饰 | 第24-25页 |
| 2.5 展望 | 第25-26页 |
| 试验研究 | 第26-59页 |
| 第三章 关中奶山羊BAC文库构建的研究 | 第26-39页 |
| 3.1 材料与方法 | 第26-32页 |
| 3.1.1 材料 | 第26-29页 |
| 3.1.1.1 菌株和质粒 | 第26页 |
| 3.1.1.2 培养基 | 第26-27页 |
| 3.1.1.3 工具酶 | 第27页 |
| 3.1.1.4 试剂 | 第27页 |
| 3.1.1.5 主要仪器 | 第27页 |
| 3.1.1.6 主要溶液 | 第27-29页 |
| 3.1.2 方法 | 第29-32页 |
| 3.1.2.1 BAC载体的制备 | 第29页 |
| 3.1.2.2 高分子量DNA的制备 | 第29页 |
| 3.1.2.3 高分子量DNA的纯化 | 第29-30页 |
| 3.1.2.4 部分酶切条件的优化 | 第30页 |
| 3.1.2.5 电透析法回收DNA | 第30-31页 |
| 3.1.2.6 β-琼脂糖酶Ⅰ法回收DNA | 第31页 |
| 3.1.2.7 电击感受态细胞的制备 | 第31页 |
| 3.1.2.8 连接与点透析 | 第31页 |
| 3.1.2.9 电击转化 | 第31-32页 |
| 3.2 结果 | 第32-34页 |
| 3.2.1 部分酶切条件的优化 | 第32-33页 |
| 3.2.2 回收DNA浓度的确定 | 第33页 |
| 3.2.3 连接和转化条件的优化 | 第33-34页 |
| 3.2.3.1 连接体系的设立 | 第33页 |
| 3.2.3.2 转化体系的设立 | 第33-34页 |
| 3.2.4 阳性克隆的鉴定 | 第34页 |
| 3.3 讨论 | 第34-38页 |
| 3.3.1 BAC载体制备 | 第35-36页 |
| 3.3.2 高分子量DNA的制备 | 第36页 |
| 3.3.3 大片段DNA的回收 | 第36-37页 |
| 3.3.4 连接 | 第37页 |
| 3.3.5 电击转化 | 第37-38页 |
| 3.4 小结 | 第38-39页 |
| 第四章 利用Red系统对BAC进行同源重组 | 第39-59页 |
| 4.1 材料和方法 | 第39-45页 |
| 4.1.1 材料 | 第39-41页 |
| 4.1.1.1 菌株和质粒 | 第39页 |
| 4.1.1.2 培养基 | 第39-40页 |
| 4.1.1.3 工具酶 | 第40页 |
| 4.1.1.4 试剂 | 第40页 |
| 4.1.1.5 主要仪器 | 第40-41页 |
| 4.1.1.6 主要溶液 | 第41页 |
| 4.1.2 方法 | 第41-45页 |
| 4.1.2.1 质粒的提取 | 第41-42页 |
| 4.1.2.2 引物 | 第42-43页 |
| 4.1.2.3 切胶回收 | 第43页 |
| 4.1.2.4 DNA的限制性酶切(完全酶切)及外源DNA与质粒载体的连接反应 | 第43页 |
| 4.1.2.5 连接产物的转化反应 | 第43页 |
| 4.1.2.6 化学法制备大肠杆菌感受态细胞DH10B | 第43-44页 |
| 4.1.2.7 Red重组功能的诱导和电击感受态细胞的制备 | 第44页 |
| 4.1.2.8 电击转化 | 第44-45页 |
| 4.1.2.9 阳性克隆的鉴定 | 第45页 |
| 4.1.2 10大量提取质粒 | 第45页 |
| 4.2 结果 | 第45-54页 |
| 4.2.1 PCR扩增目的基因 | 第45-47页 |
| 4.2.1.1 天然ht-PA的扩增 | 第45-46页 |
| 4.2.1.2 Zeocin抗性基因的扩增 | 第46页 |
| 4.2.1.3 BGHpA的扩增 | 第46-47页 |
| 4.2.2 天然ht-PAZeo载体的构建 | 第47-48页 |
| 4.2.3 天然ht-PABZeo载体的构建 | 第48-50页 |
| 4.2.4 电击转化 | 第50-51页 |
| 4.2.5 PCR鉴定同源重组阳性克隆 | 第51-53页 |
| 4.2.5.1 天然ht-PAZeo同源重组的PCR鉴定 | 第51-53页 |
| 4.2.6 测序鉴定同源重组阳性克隆 | 第53-54页 |
| 4.3 讨论 | 第54-58页 |
| 4.3.1 Red重组系统基因置换方案 | 第55-56页 |
| 4.3.2 同源臂的设计 | 第56-57页 |
| 4.3.3 减少假阳性 | 第57页 |
| 4.3.4 含有Red系统的电击感受态的制备 | 第57页 |
| 4.3.5 电击转化 | 第57-58页 |
| 4.4 小结 | 第58-59页 |
| 结 论 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-66页 |
| 致 谢 | 第66-67页 |
| 作者简介 | 第67页 |
