| 摘要 | 第9-12页 |
| ABSTRACT | 第12-15页 |
| 符号与缩略语说明 | 第16-17页 |
| 前言 | 第17-18页 |
| 文献综述 三苯甲烷类染料的生物降解研究进展 | 第18-42页 |
| 1 三苯甲烷类染料概述 | 第18-24页 |
| 1.1 三苯甲烷类染料的用途、分类和主要化合物结构 | 第18-20页 |
| 1.2 三苯甲烷染料对水环境的污染 | 第20页 |
| 1.3 孔雀石绿对水产品的污染和对人类的危害 | 第20-23页 |
| 1.3.1 孔雀石绿的性质 | 第20-21页 |
| 1.3.2 孔雀石绿的应用 | 第21-22页 |
| 1.3.3 孔雀石绿对水生动物的毒性 | 第22页 |
| 1.3.4 孔雀石绿对人和哺乳动物的毒性 | 第22-23页 |
| 1.4 孔雀石绿及其代谢产物的检测方法 | 第23-24页 |
| 2 水体中三苯甲烷类染料的去除研究 | 第24-29页 |
| 2.1 化学和物理方法 | 第24-25页 |
| 2.2 生物技术方法 | 第25-29页 |
| 2.2.1 分离筛选高效降解微生物 | 第25-27页 |
| 2.2.2 优化外界环境因素 | 第27-28页 |
| 2.2.3 共代谢降解 | 第28-29页 |
| 3 三苯甲烷类染料生物降解的机理研究 | 第29-33页 |
| 3.1 降解途径 | 第29-31页 |
| 3.2 微生物降解三苯甲烷类染料的酶学研究 | 第31-32页 |
| 3.3 微生物降解三苯甲烷类染料的基因克隆和表达研究 | 第32-33页 |
| 4 微生物降解三苯甲烷类染料研究的前景与展望 | 第33-34页 |
| 参考文献 | 第34-42页 |
| 实验部分 | 第42-120页 |
| 第一章 孔雀石绿降解菌的分离鉴定及其生长和降解特性研究 | 第42-72页 |
| 1 材料与方法 | 第43-46页 |
| 1.1 菌株、培养基与试剂 | 第43页 |
| 1.2 降解菌株的富集、分离与纯化 | 第43页 |
| 1.3 降解菌株的16S rDNA序列分析 | 第43-45页 |
| 1.3.1 降解菌株总DNA的提取 | 第43-44页 |
| 1.3.2 降解菌株16S rDNA的PCR扩增 | 第44页 |
| 1.3.3 PCR产物的T/A克隆 | 第44页 |
| 1.3.4 感受态细胞的制备和转化 | 第44-45页 |
| 1.3.5 质粒DNA的小量提取 | 第45页 |
| 1.3.6 16S rDNA序列测定 | 第45页 |
| 1.4 降解菌株系统发育地位的确定 | 第45页 |
| 1.5 降解菌株的形态特征及生理生化鉴定 | 第45页 |
| 1.6 菌体生长量的测定 | 第45页 |
| 1.7 孔雀石绿含量的测定 | 第45-46页 |
| 1.8 无色孔雀石绿含量的检测 | 第46页 |
| 1.9 MDB-1对其它染料的降解 | 第46页 |
| 2 结果与分析 | 第46-66页 |
| 2.1 孔雀石绿检测方法的验证 | 第46-47页 |
| 2.2 环境样品中孔雀石绿降解菌株的分离筛选 | 第47-50页 |
| 2.2.1 孔雀石绿降解菌株的初筛 | 第47-49页 |
| 2.2.2 孔雀石绿降解菌株的复筛 | 第49-50页 |
| 2.3 MDB-1的菌落和个体形态 | 第50-51页 |
| 2.4 MDB-1的16S rDNA序列分析 | 第51-52页 |
| 2.4.1 基因组DNA的提取 | 第51页 |
| 2.4.2 MDB-1的系统发育地位的确定 | 第51-52页 |
| 2.5 MDB-1的生理生化特性 | 第52-54页 |
| 2.5.1 MDB-1与近缘种的比较 | 第52-53页 |
| 2.5.2 MDB-1对95种碳源的利用 | 第53-54页 |
| 2.6 环境条件对降解菌株MDB-1生长的影响 | 第54-58页 |
| 2.6.1 温度对菌株MDB-1生长的影响 | 第54-55页 |
| 2.6.2 pH对菌株MDB-1生长的影响 | 第55页 |
| 2.6.3 装液量对菌株MDB-1生长的影响 | 第55-56页 |
| 2.6.4 NaCl对菌株MDB-1生长的影响 | 第56页 |
| 2.6.5 不同碳源对菌株MDB-1生长的影响 | 第56-57页 |
| 2.6.6 不同氮源对菌株MDB-1生长的影响 | 第57页 |
| 2.6.7 MDB-1对抗生素的耐受性 | 第57-58页 |
| 2.7 MDB-1在最适生长条件下的生长曲线 | 第58-59页 |
| 2.8 MDB-1对孔雀石绿的降解 | 第59-60页 |
| 2.9 环境条件对MDB-1降解孔雀石绿的影响 | 第60-64页 |
| 2.9.1 孔雀石绿起始浓度对MDB-1降解孔雀石绿的影响 | 第60页 |
| 2.9.2 初始pH值对MDB-1降解孔雀石绿的影响 | 第60-61页 |
| 2.9.3 温度对MDB-1降解孔雀石绿的影响 | 第61-62页 |
| 2.9.4 装液量对MDB-1降解孔雀石绿的影响 | 第62页 |
| 2.9.5 接种量对MDB-1降解孔雀石绿的影响 | 第62-63页 |
| 2.9.6 不同碳源对MDB-1降解孔雀石绿的影响 | 第63-64页 |
| 2.9.7 不同氮源对MDB-1降解孔雀石绿的影响 | 第64页 |
| 2.10 MDB-1在低浓度孔雀石绿下的降解 | 第64-65页 |
| 2.11 MDB-1在连续添加孔雀石绿情况下的降解情况 | 第65-66页 |
| 2.12 MDB-1降解对其他染料的降解 | 第66页 |
| 3 讨论 | 第66-68页 |
| 本章小结 | 第68页 |
| 参考文献 | 第68-72页 |
| 第二章 孔雀石绿降解关键基因的克隆及其侧翼序列分析 | 第72-86页 |
| 1 材料与方法 | 第72-75页 |
| 1.1 培养基与试剂 | 第72页 |
| 1.2 菌株与质粒 | 第72-73页 |
| 1.3 菌体总DNA和质粒DNA的提取 | 第73页 |
| 1.4 三苯甲烷还原酶基因的引物设计和PCR扩增 | 第73页 |
| 1.5 侧翼序列SEFA-PCR引物设计和PCR扩增 | 第73-75页 |
| 1.6 产物的酶连、转化与阳性克隆的筛选 | 第75页 |
| 1.7 序列测定、比较与分析 | 第75页 |
| 2 结果与讨论 | 第75-83页 |
| 2.1 PCR法克隆三苯甲烷还原酶基因 | 第75-76页 |
| 2.2 序列测定与比较分析 | 第76-81页 |
| 2.2.1 基因水平上的比较 | 第76-78页 |
| 2.2.2 氨基酸水平上的比较 | 第78-81页 |
| 2.3 tmr2基因侧翼序列的扩增及分析 | 第81-82页 |
| 2.4 对tmr2基因上下游序列的分析 | 第82-83页 |
| 本章小结 | 第83-84页 |
| 参考文献 | 第84-86页 |
| 第三章 tmr2基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的性质研究 | 第86-102页 |
| 1 材料与方法 | 第86-90页 |
| 1.1 培养基与试剂 | 第86-87页 |
| 1.2 菌株与质粒 | 第87页 |
| 1.3 三苯甲烷还原酶基因tmr2的PCR扩增 | 第87页 |
| 1.4 三苯甲烷还原酶基因表达载体的构建 | 第87页 |
| 1.4.1 PCR产物和pET29a载体双酶切 | 第87页 |
| 1.4.2 酶切产物的纯化、酶连、转化与筛选 | 第87页 |
| 1.5 重组酶的表达和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 | 第87-88页 |
| 1.5.1 重组酶的表达和样品处理 | 第87-88页 |
| 1.5.2 聚丙烯酰胺凝胶的灌制 | 第88页 |
| 1.5.3 电泳 | 第88页 |
| 1.5.4 染色脱色 | 第88页 |
| 1.6 重组蛋白酶液的制备和纯化 | 第88-89页 |
| 1.7 蛋白含量的测定 | 第89页 |
| 1.8 重组蛋白酶活性的检测 | 第89页 |
| 1.9 三苯甲烷还原酶的酶活力测定 | 第89页 |
| 1.10 三苯甲烷还原酶反应时间与酶浓度的确定 | 第89-90页 |
| 1.11 三苯甲烷还原酶对NADH及NADPH的依赖性试验 | 第90页 |
| 1.12 反应条件对三苯甲烷还原酶活性的影响 | 第90页 |
| 1.12.1 温度对三苯甲烷还原酶活性的影响及酶的热稳定性 | 第90页 |
| 1.12.2 pH对三苯甲烷还原酶活性的影响及酶的酸碱稳定性 | 第90页 |
| 1.12.3 金属离子对三苯甲烷还原酶活性的影响 | 第90页 |
| 2 结果 | 第90-98页 |
| 2.1 表达载体构建 | 第90-93页 |
| 2.2 重组蛋白的诱导表达和SDS-PAGE分析 | 第93-94页 |
| 2.3 表达蛋白的三苯甲烷还原酶活性检测和蛋白质含量测定 | 第94页 |
| 2.4 三苯甲烷还原酶的反应进程曲线与酶浓度曲线 | 第94-95页 |
| 2.5 三苯甲烷还原酶对NADH及NADPH的依赖性试验 | 第95-96页 |
| 2.6 反应条件对酶活性的影响 | 第96-98页 |
| 2.6.1 三苯甲烷还原酶反应的最适温度和酶的热稳定性 | 第96-97页 |
| 2.6.2 三苯甲烷还原酶反应的最适pH和酶的酸碱稳定性 | 第97-98页 |
| 2.6.3 金属离子对三苯甲烷还原酶活性的影响 | 第98页 |
| 3 讨论 | 第98-99页 |
| 本章小结 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-102页 |
| 第四章 tmr2基因在毕赤酵母中的表达及条件优化 | 第102-120页 |
| 第一节 tmr2基因在毕赤酵母中的表达 | 第103-111页 |
| 1 材料与方法 | 第103-107页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第103页 |
| 1.2 酶及生化试剂 | 第103页 |
| 1.3 培养基及有关的溶液配制 | 第103页 |
| 1.4 培养条件 | 第103页 |
| 1.5 引物设计 | 第103页 |
| 1.6 PCR反应条件和反应体系 | 第103-104页 |
| 1.7 克隆质粒pMD18-T-AS的构建 | 第104-105页 |
| 1.8 重组表达载体的线性化 | 第105页 |
| 1.9 毕赤酵母感受态细胞的制备及转化 | 第105页 |
| 1.10 酵母基因组DNA的提取 | 第105页 |
| 1.11 重组酵母的PCR验证 | 第105-106页 |
| 1.12 tmr2基因在毕赤酵母中的诱导表达 | 第106页 |
| 1.13 表达蛋白的SDS-PAGE分析 | 第106页 |
| 1.14 表达蛋白酶谱检测 | 第106页 |
| 1.15 表达蛋白酶活性的检测 | 第106-107页 |
| 2 结果与讨论 | 第107-111页 |
| 2.1 表达载体构建 | 第107-109页 |
| 2.2 tmr2基因在毕赤酵母中表达蛋白的SDS-PAGE分析 | 第109页 |
| 2.3 表达蛋白的酶谱分析 | 第109-110页 |
| 2.4 表达蛋白的活性检测 | 第110-111页 |
| 第二节 酵母表达条件的优化 | 第111-116页 |
| 1 材料和方法 | 第111-112页 |
| 1.1 菌种 | 第111页 |
| 1.2 培养基 | 第111页 |
| 1.3 酵母工程菌表型的鉴定 | 第111页 |
| 1.4 摇瓶中表达重组蛋白 | 第111-112页 |
| 1.5 培养上清液中表达产物的酶活测定 | 第112页 |
| 1.6 上清液中表达产物的蛋白含量测定 | 第112页 |
| 2 结果 | 第112-116页 |
| 2.1 酵母工程菌Mut+/Muts表型鉴定 | 第112页 |
| 2.2 培养基的筛选 | 第112-113页 |
| 2.3 不同诱导时间下酵母细胞的生长和上清液酶活 | 第113页 |
| 2.4 pH值的影响 | 第113-114页 |
| 2.5 菌体密度的影响 | 第114-115页 |
| 2.6 甲醇诱导浓度的影响 | 第115页 |
| 2.7 优化后菌体的生长和上清液酶活 | 第115-116页 |
| 3 讨论 | 第116页 |
| 本章小结 | 第116-117页 |
| 参考文献 | 第117-120页 |
| 全文总结 | 第120-124页 |
| 附录1 实验用培养基及分子生物学试剂 | 第124-128页 |
| 一、培养基 | 第124页 |
| 二、试剂 | 第124-128页 |
| 附录2 研究中获得的相关DNA序列 | 第128-132页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文目录 | 第132-134页 |
| 致谢 | 第134页 |
