| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 1 引言 | 第10-13页 |
| 2 材料与方法 | 第13-29页 |
| 2.1 供试材料 | 第13页 |
| 2.2 试验涉及的培养基 | 第13页 |
| 2.3 HCP1 基因的 PCR 扩增与全长序列的获得 | 第13-16页 |
| 2.3.1 总 RNA 提取及 cDNA 第一链的合成 | 第13-14页 |
| 2.3.1.1 总 RNA 提取 | 第13-14页 |
| 2.3.1.2 反转录 | 第14页 |
| 2.3.2 引物设计 | 第14-15页 |
| 2.3.3 HCP1 基因全长序列的获得 | 第15-16页 |
| 2.3.3.1 HCP1 基因的 PCR 扩增 | 第15页 |
| 2.3.3.2 PCR 产物回收 | 第15页 |
| 2.3.3.3 目的片段与 pMD19-T-vector 的连接和转化 | 第15-16页 |
| 2.3.3.4 CaCl_2法制备大肠杆菌 E.coli DH5α的感受态细胞 | 第16页 |
| 2.3.3.5 连接产物的转化 | 第16页 |
| 2.3.3.6 阳性克隆的蓝白斑筛选 | 第16页 |
| 2.4 小麦受叶锈菌侵染后 HCP1 基因在 mRNA 水平的表达变化 | 第16-18页 |
| 2.4.1 供试小麦 L10 的培养和取样 | 第16-17页 |
| 2.4.2 总 RNA 提取及纯化 | 第17页 |
| 2.4.3 RNA 反转录成 cDNA | 第17页 |
| 2.4.4 实时荧光定量 PCR（qRT-PCR） | 第17-18页 |
| 2.5 HCP1-GFP 亚细胞定位载体的构建及检测 | 第18-19页 |
| 2.5.1 HCP1-GFP 亚细胞定位载体的构建 | 第18页 |
| 2.5.2 HCP1-GFP 注射烟草瞬时表达后检测 | 第18-19页 |
| 2.5.2.1 试剂和载体质粒 | 第18页 |
| 2.5.2.2 操作步骤 | 第18-19页 |
| 2.5.3 GFP 荧光蛋白信号的 Confocal 检测 | 第19页 |
| 2.6 BSMV 载体构建 | 第19页 |
| 2.7 VIGS 体外转录产物的获得及转染 | 第19-21页 |
| 2.7.1 BSMV 质粒提取 | 第19页 |
| 2.7.2 BSMV 线性化 | 第19-20页 |
| 2.7.3 纯化回收 | 第20页 |
| 2.7.4 体外转录与转染 | 第20-21页 |
| 2.8 HCP1 基因沉默后的验证及功能检测 | 第21-22页 |
| 2.8.1 基因沉默后的验证 | 第21页 |
| 2.8.2 HR 荧光染色 | 第21-22页 |
| 2.8.3 H_2O_2的 DAB 染色 | 第22页 |
| 2.8.3.1 取材与染色 | 第22页 |
| 2.8.3.2 固定脱色 | 第22页 |
| 2.8.3.3 透明 | 第22页 |
| 2.9 HCP1 超表达植物表达载体的构建 | 第22-25页 |
| 2.9.1 载体质粒、菌株、酶 | 第22-23页 |
| 2.9.2 HCP1 基因的扩增与阳性克隆的筛选 | 第23页 |
| 2.9.3 质粒提取 | 第23-24页 |
| 2.9.4 双元表达载体构建 | 第24页 |
| 2.9.5 重组载体的鉴定 | 第24页 |
| 2.9.6 农杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第24-25页 |
| 2.10 HCP1 基因 RNAi 植物表达载体的构建 | 第25-26页 |
| 2.10.1 载体质粒、菌株、酶 | 第25页 |
| 2.10.2 HCP1 基因 RNAi 表达载体的构建 | 第25-26页 |
| 2.11 农杆菌介导的 HCP1 超表达和 RNAi 植物表达载体的遗传转化 | 第26-29页 |
| 2.11.1 植物材料 | 第26页 |
| 2.11.2 试验方法 | 第26-27页 |
| 2.11.2.1 小麦外植体的获得 | 第26页 |
| 2.11.2.2 农杆菌侵染 | 第26页 |
| 2.11.2.3 转基因植株的获得 | 第26-27页 |
| 2.11.3 转化植株的分子检测 | 第27-29页 |
| 2.11.3.1 小麦基因组的提取方法 | 第27-28页 |
| 2.11.3.2 转化植株的 PCR 鉴定 | 第28-29页 |
| 3 结果与分析 | 第29-45页 |
| 3.1 小麦 HCP1 基因的克隆 | 第29-30页 |
| 3.2 HCP1 基因亚细胞定位载体的构建 | 第30-32页 |
| 3.2.1 获得 HCP1 片段（去终止子）并与 eGFP 中间载体连接 | 第30页 |
| 3.2.2 PCR 扩增 HCP1-eGFP 融合片段 | 第30-31页 |
| 3.2.3 HCP1-eGFP 融合片段连接至载体 pCAMBIA330122 | 第31页 |
| 3.2.4 GFP 荧光蛋白信号的 Confocal 观察 | 第31-32页 |
| 3.3 小麦–叶锈菌互作过程中 HCP1 基因的实时定量检测 | 第32-33页 |
| 3.4 VIGS 技术验证 H_2O_2对 HR-PCD 的影响 | 第33-38页 |
| 3.4.1 HCP1 基因的 VIGS 载体构建和体外转录 | 第33-34页 |
| 3.4.2 基因沉默后的验证 | 第34-35页 |
| 3.4.3 HCP1 基因沉默对 H_2O_2的影响 | 第35-36页 |
| 3.4.4 HCP1 基因沉默对 HR-PCD 的影响 | 第36-38页 |
| 3.5 HCP1 基因 RNAi 载体构建 | 第38-40页 |
| 3.5.1 HCP1 正反向目的片段的获得 | 第38页 |
| 3.5.2 pTCK303-Ubi:: HCP1 载体的构建及农杆菌转化 | 第38-40页 |
| 3.6 HCP1 基因全长的超表达载体构建 | 第40-42页 |
| 3.6.1 HCP1 目的片段的获得 | 第40页 |
| 3.6.2 双元表达载体的构建 | 第40-41页 |
| 3.6.3 pCAMBIA3301-35S:: HCP1 的农杆菌转化 | 第41-42页 |
| 3.7 农杆菌介导的 HCP1 基因小麦成熟胚遗传转化 | 第42页 |
| 3.8 小麦转基因植株的检测 | 第42-45页 |
| 3.8.1 HCP1 基因超表达转化植株的 PCR 检测 | 第42-43页 |
| 3.8.2 HCP1 基因 RNAi 载体转化植株的 PCR 检测 | 第43-45页 |
| 4 讨论 | 第45-49页 |
| 4.1 H_2O_2在小麦抵御叶锈菌侵染过程中的作用 | 第45-46页 |
| 4.2 HCP1 基因在小麦抵御叶锈菌侵染过程中的作用 | 第46-47页 |
| 4.3 利用 VIGS 技术研究基因功能探讨 | 第47-49页 |
| 5 结论 | 第49-50页 |
| 参考文献 | 第50-54页 |
| 在读期间发表的学术论文 | 第54-55页 |
| 作者简介 | 第55-56页 |
| 致谢 | 第56-57页 |
