| 摘要 | 第1-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 缩略语表 | 第13-14页 |
| 第1章 文献综述 | 第14-22页 |
| ·干扰素简介 | 第14页 |
| ·结核病的流行及危害 | 第14-16页 |
| ·发病机理 | 第15页 |
| ·牛结核的流行现状及危害 | 第15页 |
| ·家畜与人之间结核病的关系 | 第15-16页 |
| ·水牛 | 第16-22页 |
| ·我国水牛发展概况 | 第16页 |
| ·水牛结核流行现状 | 第16-17页 |
| ·水牛结核诊断方法 | 第17-21页 |
| ·细菌学检查法 | 第17页 |
| ·提纯结核菌素(PPD)皮内变态反应实验 | 第17-18页 |
| ·血清学检测(ELISA诊断)方法 | 第18-19页 |
| ·分子生物学方法 | 第19页 |
| ·抗原特异性IFN-γ检测法 | 第19-21页 |
| ·展望 | 第21-22页 |
| 第2章 水牛IFN-γ的克隆、原核与酵母表达及生物活性分析 | 第22-47页 |
| ·研究的目的意义 | 第22页 |
| ·材料 | 第22-27页 |
| ·质粒及菌株 | 第22-24页 |
| ·细胞与病毒 | 第24页 |
| ·主要药品与相关试剂 | 第24页 |
| ·大肠杆菌主要培养基 | 第24页 |
| ·酵母主要培养基 | 第24-25页 |
| ·贮存液 | 第24-25页 |
| ·酵母培养基 | 第25页 |
| ·MDBK细胞培养基 | 第25页 |
| ·SDS-PAGE相关溶液的配制 | 第25-26页 |
| ·Western blot缓冲液 | 第26页 |
| ·His-tag重组蛋白纯化的溶液 | 第26页 |
| ·其他试剂的配置 | 第26-27页 |
| ·方法 | 第27-36页 |
| ·水牛IFN-γ基因的克隆 | 第27-30页 |
| ·水牛外周血的培养、淋巴细胞的分离及总RNA的提取 | 第27页 |
| ·RT-PCR的引物设计及RT-PCR | 第27-28页 |
| ·PCR产物的回收与纯化 | 第28页 |
| ·重组质粒pET-30a-BbIFN-γ和pPICZαA-BbIFN-γ的构建 | 第28-29页 |
| ·连接产物或质粒的转化 | 第29页 |
| ·质粒的提取 | 第29页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第29-30页 |
| ·水牛IFN-γ的原核表达与鉴定 | 第30-32页 |
| ·IPTG诱导表达 | 第30页 |
| ·重组蛋白可溶或不溶性表达的分析 | 第30页 |
| ·SDS-PAGE蛋白凝胶电泳 | 第30-31页 |
| ·重组可溶性蛋白的纯化 | 第31页 |
| ·重组蛋白的Western blot鉴定 | 第31-32页 |
| ·水牛IFN-γ的酵母表达 | 第32-35页 |
| ·重组质粒pPICZαA-BbIFN-γ转化感受态毕赤酵母 | 第32-34页 |
| ·重组酵母的PCR鉴定 | 第34页 |
| ·多拷贝插入重组子的筛选 | 第34页 |
| ·重组酵母菌的诱导表达 | 第34-35页 |
| ·水牛IFN-γ密码子的优化、酵母的高效表达 | 第35-36页 |
| ·水牛IFN-γ密码子的优化 | 第35-36页 |
| ·水牛IFN-γ优化序列的亚克隆 | 第36页 |
| ·水牛IFN-γ优化序列的酵母表达 | 第36页 |
| ·重组蛋白的Western blot鉴定 | 第36页 |
| ·重组BbIFN-γ生物活性分析 | 第36页 |
| ·重组原核表达蛋白BbIFN-γ抗VSV和IBRV活性的测定 | 第36页 |
| ·重组酵母表达蛋白BbIFN-γ抗VSV和IBRV活性的测定 | 第36页 |
| ·结果与分析 | 第36-44页 |
| ·水牛IFN-γ信号肽的预测 | 第36页 |
| ·水牛IFN-γ基因的克隆与鉴定 | 第36-38页 |
| ·重组BbIFN-γ的原核表达 | 第38-40页 |
| ·SDS-PAGE检测原核表达的BbIFN-γ | 第38-39页 |
| ·Western blot分析 | 第39-40页 |
| ·重组原核表达蛋白BbIFN-γ抗病毒活性的测定 | 第40页 |
| ·抗VSV活性的测定 | 第40页 |
| ·抗IBRV活性的测定 | 第40页 |
| ·重组BbIFN-γ的酵母表达 | 第40页 |
| ·重组IFN-γ优化序列的酵母高效表达 | 第40-44页 |
| ·重组质粒pPICZαA-BbIFN-γ(优)的线性化 | 第40-41页 |
| ·重组酵母菌株的筛选 | 第41-42页 |
| ·重组酵母菌的可表达性分析 | 第42页 |
| ·多拷贝插入重组子的筛选 | 第42页 |
| ·多拷贝重组酵母菌的诱导表达 | 第42-43页 |
| ·Western blot分析 | 第43-44页 |
| ·重组酵母表达蛋白BbIFN-γ抗病毒活性的测定 | 第44页 |
| ·抗VSV活性的测定 | 第44页 |
| ·抗IBRV活性的测定 | 第44页 |
| ·讨论 | 第44-47页 |
| ·RNA的提取 | 第44页 |
| ·序列的测序 | 第44页 |
| ·原核表达和毕赤酵母表达 | 第44-46页 |
| ·蛋白纯化 | 第46页 |
| ·抗病毒活性试验 | 第46-47页 |
| 第3章 抗BbIFN-γ单克隆抗体和多克隆抗体的制备 | 第47-63页 |
| ·研究的目的意义 | 第47页 |
| ·材料 | 第47-49页 |
| ·细胞和实验动物 | 第47页 |
| ·主要试剂 | 第47-48页 |
| ·有关溶液的配制 | 第48-49页 |
| ·制备单克隆抗体的有关溶液的配制 | 第48页 |
| ·ELISA主要溶液的配制 | 第48-49页 |
| ·抗体纯化的有关溶液的配制 | 第49页 |
| ·方法 | 第49-54页 |
| ·抗BbIFN-γ单克隆抗体的制备 | 第49-53页 |
| ·小鼠免疫 | 第49页 |
| ·间接ELISA检测方法的建立 | 第49-50页 |
| ·细胞融合 | 第50-51页 |
| ·杂交瘤细胞的筛选 | 第51-52页 |
| ·杂交瘤细胞的克隆(有限稀释法) | 第52页 |
| ·杂交瘤细胞的冻存与复苏 | 第52页 |
| ·单克隆抗体的生产 | 第52-53页 |
| ·腹水中单克隆抗体的纯化(辛酸--硫酸铵法) | 第53页 |
| ·抗BbIFN-γ单克隆抗体的鉴定 | 第53-54页 |
| ·单克隆抗体(腹水)的效价的测定 | 第53页 |
| ·杂交瘤细胞染色体计数 | 第53页 |
| ·单克隆抗体亚型的测定 | 第53-54页 |
| ·单克隆抗体相对亲和力的测定 | 第54页 |
| ·单克隆抗体的特异性及结合活性的鉴定 | 第54页 |
| ·抗BbIFN-γ多克隆抗体的制备 | 第54页 |
| ·日本大耳白兔的免疫 | 第54页 |
| ·抗体效价的检测 | 第54页 |
| ·多克隆抗体的纯化(辛酸--硫酸铵法) | 第54页 |
| ·结果与分析 | 第54-60页 |
| ·免疫小鼠和白兔的血清效价 | 第54-56页 |
| ·细胞融合 | 第56页 |
| ·杂交瘤细胞筛选及克隆结果 | 第56页 |
| ·单克隆抗体(腹水)的效价 | 第56-57页 |
| ·杂交痈细胞染色体计数 | 第57-58页 |
| ·单克隆抗体的亚型及相对亲和力的测定 | 第58页 |
| ·单克隆抗体的特异性及结合活性的鉴定 | 第58-59页 |
| ·抗体的纯化 | 第59-60页 |
| ·讨论 | 第60-63页 |
| ·免疫原 | 第60页 |
| ·动物免疫 | 第60-61页 |
| ·细胞融合 | 第61-62页 |
| ·阳性杂交瘤细胞的筛选 | 第62页 |
| ·杂交瘤细胞的亚克隆 | 第62页 |
| ·杂交瘤细胞的冻存与复苏 | 第62-63页 |
| 第4章 水牛IFN-γ双抗体夹心ELISA方法的建立 | 第63-69页 |
| ·研究的目的意义 | 第63页 |
| ·材料 | 第63页 |
| ·主要试剂及材料 | 第63页 |
| ·ELISA相关溶液的配制 | 第63页 |
| ·方法 | 第63-65页 |
| ·单抗最适包被浓度和夹心抗体最适工作浓度的确定 | 第63-64页 |
| ·水牛IFN-γ单克隆抗体敏感度的确定 | 第64页 |
| ·水牛IFN-γ双抗体夹心ELISA方法的建立 | 第64-65页 |
| ·结果与分析 | 第65-67页 |
| ·单抗最适包被浓度和夹心抗体最适工作浓度的确定 | 第65-66页 |
| ·水牛IFN-γ单克隆抗体敏感度 | 第66-67页 |
| ·讨论 | 第67-69页 |
| ·关于单克隆抗体的选择 | 第67页 |
| ·单抗和多抗工作浓度的确定 | 第67页 |
| ·水牛结核病IFN-γ检测方法 | 第67-69页 |
| 第5章 结论 | 第69-70页 |
| 附录 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-79页 |
| 致谢 | 第79页 |
