| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-23页 |
| 1 非编码小分子RNA定义 | 第10页 |
| 2 非编码小分子RNA的分类 | 第10-11页 |
| 3 小分子RNA与蛋白质的相互作用 | 第11页 |
| 4 PIWI基因的研究进展 | 第11-12页 |
| 5 PIRNAs的研究进展 | 第12-13页 |
| 6 鸡PGCS的生物学特性及应用 | 第13-15页 |
| ·鸡PGCs的形态特征 | 第13-14页 |
| ·鸡PGCs的起源与迁移 | 第14页 |
| ·PGCs的分离与鉴定 | 第14-15页 |
| ·PGCs在生物工程中的应用 | 第15页 |
| 7 鸡PGCs中与干细胞多能性和配子发生相关基因的研究 | 第15-17页 |
| ·CVH基因、Dazl基因、CDH基因研究进展 | 第15-16页 |
| ·PouV基因、Nanog基因、Sox2基因的研究进展 | 第16-17页 |
| 8 实时定量PCR技术 | 第17-20页 |
| ·Real-Time qPCR原理 | 第18-19页 |
| ·Real-time qPCR的种类 | 第19-20页 |
| ·Taqman(?)探针法 | 第19-20页 |
| ·SYBR(?)Green法 | 第20页 |
| 9 RNA干扰技术 | 第20-22页 |
| ·RNAi作用机制及特点 | 第20-21页 |
| ·siRNA的制备及转染方法 | 第21-22页 |
| ·RNAi的技术应用 | 第22页 |
| 10 本研究的目的和意义 | 第22-23页 |
| 第二章 鸡睾丸组织PIRNAS分子的克隆 | 第23-31页 |
| 1 实验材料 | 第23-24页 |
| ·实验动物 | 第23-24页 |
| ·主要仪器 | 第24页 |
| ·主要试剂 | 第24页 |
| 2 实验方法 | 第24-25页 |
| ·总RNA的制备 | 第24页 |
| ·未知小分子RNA的分离、纯化 | 第24-25页 |
| ·未知小分子RNA的cDNA文库的构建 | 第25页 |
| ·未知小分子RNA的T-A克隆及测序 | 第25页 |
| ·小分子RNA的生物信息学分析 | 第25页 |
| 3 实验结果 | 第25-29页 |
| ·总RNA提取及小分子RNA分离 | 第25-26页 |
| ·piRNAs的序列特征分析 | 第26-29页 |
| ·编码鸡piRNAs的基因在基因组中的分布特征及二级结构预测 | 第29页 |
| 4 讨论 | 第29-31页 |
| 第三章 REAL-TIME QPCR检测鸡PIRNAS多组织表达规律分析 | 第31-43页 |
| 1 实验材料 | 第31-32页 |
| ·实验动物 | 第31-32页 |
| ·主要仪器 | 第32页 |
| ·主要试剂 | 第32页 |
| 2 实验方法 | 第32-37页 |
| ·总RNA的分离 | 第32页 |
| ·总RNA加poly(A)尾 | 第32-33页 |
| ·已知piRNAs的cDNA文库的构建 | 第33-34页 |
| ·第一条链cDNA合成 | 第33页 |
| ·cDNA的纯化 | 第33-34页 |
| ·引物设计 | 第34页 |
| ·目的片段的PCR扩增 | 第34-35页 |
| ·扩增片段的回收和克隆测序 | 第35页 |
| ·重组质粒的提取 | 第35页 |
| ·Real-Time qPCR检测piRNAs | 第35-36页 |
| ·引物扩增效率的检测 | 第35页 |
| ·Real-Time qPCR反应优化条件 | 第35-36页 |
| ·数据分析 | 第36页 |
| ·主要分子生物学软件 | 第36-37页 |
| 3 实验结果 | 第37-41页 |
| ·常规PCR及测序结果 | 第37页 |
| ·目的基因与内参基因的标准曲线及溶解曲线 | 第37-39页 |
| ·如皋黄鸡和隐性白羽鸡piRNAs的时空表达规律 | 第39-41页 |
| 4 讨论 | 第41-43页 |
| 第四章 体外抑制PIWI基因的表达及对配子发生和干细胞多能性调控因子的影响 | 第43-56页 |
| 1 实验材料 | 第43-44页 |
| ·受精蛋 | 第43页 |
| ·主要仪器 | 第43页 |
| ·主要试剂 | 第43-44页 |
| 2 实验方法 | 第44-48页 |
| ·siRNAs的设计与合成 | 第44页 |
| ·鸡PGCs的分离和培养 | 第44-46页 |
| ·饲养层的制备 | 第44-45页 |
| ·鸡PGCs的分离 | 第45页 |
| ·鸡PGCs传代培养 | 第45页 |
| ·鸡PGCs的鉴定方法 | 第45-46页 |
| ·过碘酸希夫氏(periodic acid-Schiff,PAS)染色 | 第45页 |
| ·碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)活性检测 | 第45-46页 |
| ·阶段特异性胚胎抗原(stage-specific embryonic antigen-1,SSEA-1)鉴定 | 第46页 |
| ·siRNAs的转染 | 第46-47页 |
| ·实验准备 | 第46页 |
| ·转染条件及转染过程 | 第46-47页 |
| ·转染效率的检测 | 第47页 |
| ·靶向Piwi-siRNA特异序列的转染 | 第47页 |
| ·目的片段常规PCR的扩增 | 第47页 |
| ·Real-Time qPCR检测 | 第47-48页 |
| ·数据分析 | 第48页 |
| 3 实验结果 | 第48-53页 |
| ·PGCs的分离和鉴定 | 第48-49页 |
| ·PGCs的形态特点 | 第48-49页 |
| ·PGCs的PAS鉴定 | 第49页 |
| ·PGCs的AKP鉴定 | 第49页 |
| ·PGCs的SSEA-1鉴定 | 第49页 |
| ·siRNA转染效率的检测 | 第49-51页 |
| ·siRNA靶向抑制Piwi的表达 | 第51页 |
| ·常规PCR结果 | 第51-52页 |
| ·沉默Piwi基因的PGCs中CVH、Dazl、CDH及PouV、Nanog、Sox2的表达 | 第52-53页 |
| 4 讨论 | 第53-56页 |
| 全文结论 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-66页 |
| 致谢 | 第66-67页 |
| 攻读学位期间发表学术论文目录 | 第67-68页 |
