| 摘要 | 第1-15页 |
| Abstract | 第15-23页 |
| 第一部分 文献综述 | 第23-45页 |
| 1. 体细胞重编程的方法 | 第23-31页 |
| ·体细胞核移植(SCNT)方法 | 第23-25页 |
| ·细胞融合 | 第25-28页 |
| ·限定性转录因子介导的iPSCs技术 | 第28-29页 |
| ·细胞提取物介导的体细胞重编程 | 第29-31页 |
| 2. 体细胞重编程的机制 | 第31-39页 |
| ·基因表达的表观影响 | 第31-35页 |
| ·去分化和转分化的表观控制 | 第35-39页 |
| 3. 增强重编程效率的化学物质 | 第39-45页 |
| ·表观遗传途径 | 第39-43页 |
| ·信号通路途径 | 第43-45页 |
| 第二部分 实验部分 | 第45-122页 |
| 第一章 用于分离小鼠ESCs的三种囊胚有效生成途径研究 | 第45-77页 |
| 第一节 小鼠体内受精囊胚内细胞团(ICM)集落获取的条件优化 | 第45-53页 |
| 前言 | 第45页 |
| 1 材料 | 第45-48页 |
| ·实验动物 | 第45页 |
| ·仪器与设备 | 第45-46页 |
| ·药品与试剂 | 第46-47页 |
| ·主要溶液配制 | 第47-48页 |
| 2 方法 | 第48-49页 |
| ·小鼠的超数排卵 | 第48页 |
| ·MEFs的原代培养 | 第48页 |
| ·MEFs的传代培养和纯化 | 第48页 |
| ·MEFs的冻存与复苏 | 第48-49页 |
| ·MEFs饲养层的制备 | 第49页 |
| ·体内受精囊胚的采集与培养 | 第49页 |
| ·数据统计分析 | 第49页 |
| 3 结果与分析 | 第49-51页 |
| ·小鼠胎龄对原代MEFs分离效果的影响 | 第49-50页 |
| ·不同传代次数MEFs的培养特征 | 第50页 |
| ·不同胚龄小鼠的胚胎类型及其分布情况 | 第50-51页 |
| ·小鼠胚胎采集时间对ICM集落获取效率的影响 | 第51页 |
| ·不同囊胚培养体系对ICM集落分离培养效率的影响 | 第51页 |
| 4 讨论 | 第51-53页 |
| ·小鼠胎龄对MEFs分离和增殖的影响 | 第51-52页 |
| ·连续传代对MEFs的影响 | 第52页 |
| ·小鼠胚胎采集时间对ICM集落获取效率的影响 | 第52页 |
| ·不同囊胚培养体系对ICM集落分离培养效率的影响 | 第52-53页 |
| 5 小结 | 第53页 |
| 第二节 小鼠杂合二倍体孤雌囊胚生成途径的优化 | 第53-65页 |
| 前言 | 第53-54页 |
| 1 材料 | 第54-55页 |
| ·实验动物 | 第54页 |
| ·仪器与设备 | 第54页 |
| ·药品与试剂 | 第54页 |
| ·主要溶液的配制 | 第54-55页 |
| 2 方法 | 第55-57页 |
| ·小鼠卵母细胞的采集 | 第55-56页 |
| ·卵母细胞的激活 | 第56页 |
| ·卵母细胞的激活类型判断和核型分析 | 第56页 |
| ·激活卵母细胞的体外培养 | 第56页 |
| ·数据统计分析 | 第56-57页 |
| 3 结果与分析 | 第57-62页 |
| ·乙醇浓度和处理时间对小鼠卵母细胞孤雌激活的影响 | 第57页 |
| ·10%乙醇+6-DMAP处理所得激活卵类型的观察 | 第57-58页 |
| ·10%乙醇+6-DMAP处理对卵母细胞孤雌激活率及孤雌胚发育率的影响 | 第58页 |
| ·乙醇+6-DMAP+CB处理对杂合二倍体激活卵形成的影响 | 第58-59页 |
| ·乙醇+6-DMAP+CB处理对卵母细胞孤雌激活率及孤雌胚发育率的影响 | 第59页 |
| ·SrCl_2+CB处理所得激活卵类型的观察 | 第59-60页 |
| ·SrCl_2单独或联合CB处理对卵母细胞孤雌激活率及孤雌胚发育率的影响 | 第60页 |
| ·不同激活方法所得激活卵类型的比较 | 第60-61页 |
| ·不同激活方法对卵母细胞孤雌激活及孤雌胚发育的影响 | 第61-62页 |
| 4 讨论 | 第62-65页 |
| ·卵母细胞孤雌激活类型 | 第62-63页 |
| ·乙醇对卵母细胞孤雌激活的机制 | 第63页 |
| ·SrCl_2对卵母细胞孤雌激活的机制 | 第63-64页 |
| ·6-DMAP对二倍体激活胚的形成以及孤雌胚体外发育的影响 | 第64-65页 |
| ·CB对二倍体激活胚的形成以及孤雌胚体外发育的影响 | 第65页 |
| 5 小结 | 第65页 |
| 第三节 人工重组异期卵母细胞核二倍体孤雌囊胚的构建——含有速激核成熟新生小鼠生长初期不成熟卵母细胞和MⅡ期成熟卵母细胞基因组人工重组二倍体孤雌胚胎的构建 | 第65-77页 |
| 前言 | 第65-66页 |
| 1 材料 | 第66-67页 |
| ·实验动物 | 第66页 |
| ·仪器与设备 | 第66页 |
| ·药品与试剂 | 第66页 |
| ·主要溶液配制 | 第66-67页 |
| 2 方法 | 第67-69页 |
| ·新生小鼠生长初期卵母细胞的采集 | 第67页 |
| ·GV期卵母细胞的采集 | 第67页 |
| ·MⅡ期卵母细胞的获取 | 第67页 |
| ·荧光染色 | 第67-68页 |
| ·去核针的制作 | 第68页 |
| ·固定管的制作 | 第68页 |
| ·凹窝的制作 | 第68页 |
| ·新生小鼠生长初期卵母细胞与去除生发泡的卵母细胞重构胚的构建 | 第68-69页 |
| ·含有速激核成熟新生小鼠生长初期卵母细胞与成年鼠成熟卵母细胞基因组的二倍体小鼠孤雌胚胎的构建 | 第69页 |
| ·含有速激核成熟新生小鼠生长初期卵母细胞与成年鼠成熟卵母细胞基因组的二倍体小鼠孤雌胚胎的体外培养 | 第69页 |
| ·数据统计分析 | 第69页 |
| 3 结果与分析 | 第69-72页 |
| ·透明带对GV期卵母细胞去核效果的影响 | 第69-70页 |
| ·不同浓度CB处理对GV期卵母细胞去核效果的影响 | 第70页 |
| ·不同黏合体系对新生小鼠生长初期卵母细胞与去除生发泡卵母细胞黏合效果的影响 | 第70-71页 |
| ·不同电融合参数对新生小鼠生长初期卵母细胞与去除生发泡卵母细胞重构胚融合效果的影响 | 第71-72页 |
| ·不同化学激活方法对含有新生小鼠生长初期卵母细胞核区和MⅡ期孵母细胞的重构细胞激活效果的影响 | 第72页 |
| 4 讨论 | 第72-76页 |
| ·透明带对GV期卵母细胞去核效果的影响 | 第72-73页 |
| ·不同浓度CB处理对卵母细胞去核效果的影响 | 第73-74页 |
| ·不同黏合体系新生小鼠生长初期卵母细胞与去除生发泡的卵母细胞黏合效果的影响 | 第74页 |
| ·不同电融合参数对核移植重构胚融合效果的影响 | 第74-75页 |
| ·不同化学激活方法对核移植重构细胞激活效果的影响 | 第75-76页 |
| 5 小结 | 第76-77页 |
| 第二章 小鼠ESCs、pESCs和重构pESCs的分离、培养与鉴定 | 第77-95页 |
| 第一节 小鼠体内受精囊胚来源ESCs的分离、培养与鉴定 | 第77-88页 |
| 前言 | 第77页 |
| 1 材料 | 第77-79页 |
| ·实验动物 | 第77页 |
| ·仪器与设备 | 第77-78页 |
| ·药品与试剂 | 第78页 |
| ·主要溶液的配制 | 第78-79页 |
| 2 方法 | 第79-85页 |
| ·雌性、雄性MEFs饲养层的制备 | 第79-81页 |
| ·小鼠ESCs的分离培养 | 第81页 |
| ·小鼠ESCs的鉴定 | 第81-85页 |
| ·体内受精囊胚来源ESCs的性别鉴定 | 第85页 |
| ·数据统计分析 | 第85页 |
| 3 结果与分析 | 第85-87页 |
| ·全胚法和免疫外科法对ESCs集落形成的影响 | 第85-86页 |
| ·ESCs的鉴定 | 第86页 |
| ·MEFs和ESCs的性别鉴定 | 第86-87页 |
| 4 讨论 | 第87-88页 |
| 5 小结 | 第88页 |
| 第二节 昆明小鼠孤雌囊胚来源pESCs的分离、培养与鉴定 | 第88-91页 |
| 前言 | 第88-89页 |
| 1 材料 | 第89页 |
| ·实验动物 | 第89页 |
| ·仪器与设备 | 第89页 |
| ·药品与试剂 | 第89页 |
| ·主要溶液的配制 | 第89页 |
| 2 方法 | 第89-90页 |
| ·pESCs的分离、培养与鉴定 | 第89-90页 |
| ·数据统计分析 | 第90页 |
| 3 结果与分析 | 第90页 |
| 4 讨论 | 第90-91页 |
| ·孤雌囊胚透明带对pESCs分离效果的影响 | 第90-91页 |
| ·孤雌囊胚的染色体倍性对pESCs分离和培养效果的影响 | 第91页 |
| 5 小结 | 第91页 |
| 第三节 异期二倍染色体重构胚胎来源pESCs的分离、培养与鉴定 | 第91-95页 |
| 前言 | 第91-92页 |
| 1 材料 | 第92页 |
| ·实验动物 | 第92页 |
| ·仪器与设备 | 第92页 |
| ·药品与试剂 | 第92页 |
| ·主要溶液的配制 | 第92页 |
| 2 方法 | 第92页 |
| 3 结果与分析 | 第92-93页 |
| 4 讨论 | 第93页 |
| 5 小结 | 第93-95页 |
| 第三章 应用小鼠ESCs裂解液重编程逆转化MEFs为多能干细胞的研究 | 第95-113页 |
| 第一节 不同浓度SLO对MEFs生长状态的影响 | 第95-100页 |
| 前言 | 第95-96页 |
| 1 材料 | 第96页 |
| ·实验动物 | 第96页 |
| ·仪器与设备 | 第96页 |
| ·药品与试剂 | 第96页 |
| ·主要溶液的配制 | 第96页 |
| 2 方法 | 第96-97页 |
| ·MEFs的分离、培养与传代 | 第96页 |
| ·MEFs的渗透化处理 | 第96页 |
| ·细胞计数和细胞存活率的统计 | 第96-97页 |
| ·MEFs贴壁率的统计 | 第97页 |
| ·SLO渗透化处理MEFs的生长曲线制作 | 第97页 |
| ·数据统计分析 | 第97页 |
| 3 结果与分析 | 第97-99页 |
| ·不同浓度SLO对MEFs损伤作用的影响 | 第97-98页 |
| ·CaCl_2封膜作用后经不同浓度SLO渗透化处理MEFs的生长能力恢复情况 | 第98页 |
| ·25U SLO渗透化处理MEFs的生长曲线 | 第98-99页 |
| 4 讨论 | 第99页 |
| 5 小结 | 第99-100页 |
| 第二节 昆明小鼠体内受精囊胚来源ESCs裂解液的制备 | 第100-102页 |
| 前言 | 第100页 |
| 1 材料 | 第100-101页 |
| ·实验动物 | 第100页 |
| ·仪器与设备 | 第100页 |
| ·药品与试剂 | 第100页 |
| ·主要溶液配制 | 第100-101页 |
| 2 方法 | 第101页 |
| 3 结果与分析 | 第101-102页 |
| 4 讨论 | 第102页 |
| 5 小结 | 第102页 |
| 第三节 小鼠ESCs裂解液与MEFs共孵育体系的研究 | 第102-113页 |
| 前言 | 第102-103页 |
| 1 材料 | 第103-104页 |
| ·实验动物 | 第103-104页 |
| ·仪器与设备 | 第104页 |
| ·药品与试剂 | 第104页 |
| ·主要溶液配制 | 第104页 |
| 2 方法 | 第104-105页 |
| ·TSA和5-Aza-dC处理雄性MEFs | 第104-105页 |
| ·不同性别MEFs的渗透化处理 | 第105页 |
| ·不同来源ESCs裂解液的制备 | 第105页 |
| ·不同性别MEFs与不同来源ESCs裂解液共孵育 | 第105页 |
| ·重编程所得多能干细胞的鉴定 | 第105页 |
| ·数据统计分析 | 第105页 |
| 3 结果与分析 | 第105-107页 |
| ·供、受体细胞性别对ESCs裂解液介导的体细胞重编程效率的影响 | 第106页 |
| ·不同处理方法对雄性MEFs重编程逆转化形成多能干细胞集落数的影响 | 第106-107页 |
| ·ESCs裂解液重编程雄性MEFs所得多能干细胞的鉴定 | 第107页 |
| 4 讨论 | 第107-111页 |
| ·不同来源ESCs裂解物介导的体细胞重编程 | 第108页 |
| ·父源基因对体细胞重编程效率的影响 | 第108-109页 |
| ·TSA和5-Aza-dC对体细胞重编程效率的影响 | 第109-110页 |
| ·ESCs诱导体细胞重编程的效率分析 | 第110-111页 |
| 5 小结 | 第111-113页 |
| 第四章 小鼠ESCs裂解液介导MEFs重编程所得多能干细胞集落的来源鉴定 | 第113-117页 |
| 前言 | 第113页 |
| 1 材料 | 第113-114页 |
| ·实验动物 | 第113页 |
| ·仪器与设备 | 第113-114页 |
| ·药品与试剂 | 第114页 |
| ·主要溶液配制 | 第114页 |
| 2 方法 | 第114页 |
| 3 结果与分析 | 第114页 |
| 4 讨论 | 第114-116页 |
| 5 小结 | 第116-117页 |
| 第五章 小鼠ESCs裂解液诱导鸡胚体细胞重编程的可行性研究 | 第117-122页 |
| 前言 | 第117页 |
| 1 材料 | 第117-118页 |
| ·实验动物 | 第117页 |
| ·仪器与设备 | 第117页 |
| ·药品与试剂 | 第117页 |
| ·主要溶液配制 | 第117-118页 |
| 2 方法 | 第118-119页 |
| ·鸡胚成纤维细胞的原代培养 | 第118页 |
| ·鸡胚成纤维细胞的传代培养 | 第118页 |
| ·鸡胚成纤维细胞的预处理 | 第118页 |
| ·小鼠ESCs裂解液的制备 | 第118页 |
| ·小鼠ESCs裂解液与鸡胚成纤维细胞的共孵育 | 第118-119页 |
| ·重编程所得多能干细胞的鉴定 | 第119页 |
| ·重编程所得多能干细胞的来源鉴定 | 第119页 |
| 3 结果与分析 | 第119-120页 |
| ·鸡胚成纤维细胞的形态学观察 | 第119页 |
| ·小鼠ESCs裂解液重编程鸡胚成纤维细胞的效果观察 | 第119-120页 |
| 4 讨论 | 第120-121页 |
| 5 小结 | 第121-122页 |
| 总结论 | 第122-123页 |
| 参考文献 | 第123-141页 |
| 附录：实验图片 | 第141-148页 |
| 附录：缩略词表 | 第148-151页 |
| 致谢 | 第151-152页 |
| 发表论文及参加课题一览表 | 第152页 |
