| 第一章 文献综述 | 第1-43页 |
| 1 养殖扇贝大规模死亡的相关因素 | 第13-15页 |
| 1．1 环境因素 | 第13-14页 |
| 1．2 病原微生物 | 第14-15页 |
| 2 应激反应相关蛋白及基因研究进展 | 第15-32页 |
| 2．1 热休克蛋白70(HSP70) | 第16-23页 |
| 2．1．1 HSP70的分子结构 | 第16-17页 |
| 2．1．2 HSP70的生物学功能 | 第17-20页 |
| 2．1．3 HSP70基因研究进展 | 第20-23页 |
| 2．2 色氨酸双加氧酶(TDO) | 第23-28页 |
| 2．2．1 TDO生物功能 | 第23-26页 |
| 2．2．2 TDO基因研究进展 | 第26-28页 |
| 2．3 其它相关蛋白及基因研究进展 | 第28-32页 |
| 2．3．1 金属硫蛋白 | 第28-29页 |
| 2．3．2 溶菌酶 | 第29-31页 |
| 2．3．3 抗菌肽 | 第31-32页 |
| 3 肌球蛋白及其基因研究进展 | 第32-35页 |
| 3．1 肌球蛋白结构及分类 | 第32-33页 |
| 3．2 肌球蛋白功能 | 第33-34页 |
| 3．3 肌球蛋白基因研究进展 | 第34-35页 |
| 4 目的基因筛选的常用技术 | 第35-43页 |
| 4．1 差减杂交与抑制性差减杂交 | 第36-37页 |
| 4．2 代表性差异分析 | 第37-38页 |
| 4．3 基因表达系列分析 | 第38-39页 |
| 4．4 cDNA微阵列技术 | 第39页 |
| 4．5 差异显示反转录PCR | 第39-43页 |
| 第二章 应激前后栉孔扇贝基因表达差异分析 | 第43-63页 |
| 0 前言 | 第43页 |
| 第一节 高温胁迫对栉孔扇贝基因表达影响的分析 | 第43-57页 |
| 1 材料与方法 | 第44-49页 |
| 1．1 材料 | 第44-46页 |
| 1．1．1 工具酶 | 第44页 |
| 1．1．2 引物 | 第44-45页 |
| 1．1．3 试剂 | 第45-46页 |
| 1．2 方法 | 第46-49页 |
| 1．2．1 栉孔扇贝RNA提取 | 第46-47页 |
| 1．2．2 琼脂糖电泳 | 第47页 |
| 1．2．3 总 RNA样品中微量DNA的去除 | 第47页 |
| 1．2．4 反转录合成cDNA第一链 | 第47-48页 |
| 1．2．5 DDRT-PCR | 第48页 |
| 1．2．6 DDRT-PCR产物的丙稀酰胺凝胶电泳分析 | 第48-49页 |
| 2 结果 | 第49-54页 |
| 2．1 总 RNA提取结果 | 第49-50页 |
| 2．2 扩增条带类型 | 第50-51页 |
| 2．3 不同引物组合的差异显示结果不同 | 第51-52页 |
| 2．4 高温胁迫处理前后栉孔扇贝基因表达差异比较 | 第52-54页 |
| 3 讨论 | 第54-57页 |
| 第二节 鳗弧菌胁迫对栉孔扇贝基因表达影响的分析 | 第57-63页 |
| 1 材料与方法 | 第57-58页 |
| 1．1 材料 | 第57-58页 |
| 1．1．1 实验动物 | 第57-58页 |
| 1．2 方法 | 第58页 |
| 2 结果 | 第58-60页 |
| 2．1 不同引物组合扩增结果比较 | 第58-60页 |
| 2．2 鳗弧菌应激前后栉孔扇贝基因表达差异比较 | 第60页 |
| 3 讨论 | 第60-63页 |
| 第三章 栉孔扇贝色氨酸加氧酶基因克隆及表达 | 第63-94页 |
| 0 前言 | 第63-64页 |
| 1 材料与方法 | 第64-75页 |
| 1．1 材料 | 第64-67页 |
| 1．1．1 实验动物 | 第64页 |
| 1．1．2 工具酶 | 第64页 |
| 1．1．3 引物 | 第64-65页 |
| 1．1．4 载体 | 第65页 |
| 1．1．5 菌株 | 第65页 |
| 1．1．6 试剂 | 第65-67页 |
| 1．2 方法 | 第67-75页 |
| 1．2．1 差异片断回收 | 第67页 |
| 1．2．2 差异片断二次扩增 | 第67页 |
| 1．2．3 制备大肠杆菌DH5α感受态细胞 | 第67-68页 |
| 1．2．4 差异片断克隆 | 第68页 |
| 1．2．5 克隆筛选 | 第68-69页 |
| 1．2．6 测序 | 第69页 |
| 1．2．7 RT-PCR | 第69页 |
| 1．2．8 合成5′-RACE-Ready cDNA | 第69页 |
| 1．2．9 5′RACE扩增 | 第69-71页 |
| 1．2．10 5′RACE扩增产物克隆测序 | 第71页 |
| 1．2．11 PCR扩增TDO完整ORF | 第71页 |
| 1．2．12 酶切PCR产物和pGEX-4T-3质粒 | 第71页 |
| 1．2．13 琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物 | 第71页 |
| 1．2．14 连接酶切后的PCR产物与载体 | 第71页 |
| 1．2．15 转化连接产物至BL21(DE3) | 第71-72页 |
| 1．2．16 测序 | 第72页 |
| 1．2．17 诱导表达TDO | 第72页 |
| 1．2．18 SDS-PAGE电泳 | 第72-73页 |
| 1．2．19 融合蛋白的纯化 | 第73页 |
| 1．2．20 包涵体的变性复性 | 第73页 |
| 1．2．21 抗体制备 | 第73页 |
| 1．2．22 Western Blotting | 第73-74页 |
| 1．2．23 组织总蛋白提取 | 第74页 |
| 1．2．24 免疫组化 | 第74-75页 |
| 2 结果 | 第75-88页 |
| 2．1 差异片断回收克隆 | 第75-77页 |
| 2．2 RT-PCR | 第77页 |
| 2．3 5′RACE扩增 | 第77-82页 |
| 2．4 TDO ORF扩增结果 | 第82页 |
| 2．5 诱导表达TDO-GST融合蛋白 | 第82-84页 |
| 2．6 TDO-GST融合蛋白包涵体变性复性 | 第84-85页 |
| 2．7 抗血清特异性检测 | 第85-86页 |
| 2．8 RT-PCR | 第86-87页 |
| 2．9 western blotting | 第87页 |
| 2．10 免疫组化 | 第87-88页 |
| 3 讨论 | 第88-94页 |
| 3．1 获得基因全长的方法的选择 | 第88-89页 |
| 3．2 栉孔扇贝TDO序列分析 | 第89-90页 |
| 3．3 应激与TDO表达关系的分析 | 第90页 |
| 3．4 栉孔扇贝TDO基因的融合表达 | 第90-91页 |
| 3．5 包涵体蛋白的溶解复性 | 第91页 |
| 3．6 抗血清的特异性 | 第91-92页 |
| 3．7 栉孔扇贝TDO组织表达 | 第92页 |
| 3．8 栉孔扇贝TDO的细胞分布 | 第92-94页 |
| 第四章 栉孔扇贝HSP70基因克隆及3′UTR序列变化与栉孔扇贝抗逆能力关系分析 | 第94-122页 |
| 0 前言 | 第94-95页 |
| 第一节 栉孔扇贝HSP70基因克隆 | 第95-109页 |
| 1 材料与方法 | 第95-97页 |
| 1．1 材料 | 第95页 |
| 1．1．1 实验动物 | 第95页 |
| 1．1．2 引物 | 第95页 |
| 1．2 方法 | 第95-97页 |
| 1．2．1 总 RNA提取 | 第96页 |
| 1．2．2 3′RACE cDNA第一链合成 | 第96页 |
| 1．2．3 扩增 HSP70 cDNA序列 | 第96页 |
| 1．2．3 基因组 DNA提取 | 第96页 |
| 1．2．S PCR扩增Hsp70基因片断 | 第96页 |
| 1．2．6 目的片断克隆 | 第96页 |
| 1．2．7 RT-PCR | 第96-97页 |
| 2 结果 | 第97-105页 |
| 2．1 HSP70基因cDNA扩增结果 | 第97页 |
| 2．2 栉孔扇贝HSP70基因cDNA序列 | 第97-100页 |
| 2．3 HSP70基因DNA扩增产物结果 | 第100页 |
| 2．4 栉孔扇贝HSP70基因DNA序列 | 第100-105页 |
| 2．5 RT-PCR | 第105页 |
| 3 讨论 | 第105-109页 |
| 第二节 栉孔扇贝个体内HSP70 3′UTR序列变化与抗逆能力关系分析 | 第109-122页 |
| 1 材料与方法 | 第109-111页 |
| 1．1 材料 | 第109-110页 |
| 1．1．1 实验动物 | 第109-110页 |
| 1．1．2 引物 | 第110页 |
| 1．1．3 试剂 | 第110页 |
| 1．2 方法 | 第110-111页 |
| 1．2．1 基因组DNA提取 | 第110页 |
| 1．2．2 PCR扩增栉孔扇贝3′UTR | 第110页 |
| 1．2．3 PCR产物丙稀酞胺电泳检测 | 第110页 |
| 1．2．4 PCR产物WAVE系统检测 | 第110-111页 |
| 1．2．5 混合 PCR产物梯度变性退火 | 第111页 |
| 1．2．6 克隆测序 | 第111页 |
| 2 结果 | 第111-118页 |
| 2．1 扩增产物的电泳检测 | 第111-112页 |
| 2．2 扩增产物的非变性PAGE检测 | 第112页 |
| 2．3 三群体扩增产物的WAVE检测 | 第112-114页 |
| 2．4 不同抗性群体个体内HSP70 3′UTR序列变异统计 | 第114-116页 |
| 2．5 个体内HSP70 3′UTR序列变化与耐热能力的关系 | 第116-117页 |
| 2．6 栉孔扇贝HSP70 3′ UTR内富含AU的序列 | 第117-118页 |
| 3 讨论 | 第118-122页 |
| 3．1 个体内插入缺失和点突变的检出 | 第118-119页 |
| 3．2 不同抗性群体HSP70基因3′UTR序列变异分析 | 第119-120页 |
| 3．3 热激条件下野生栉孔扇贝抗逆能力与HSP70基因3′UTR变异关系分析 | 第120-122页 |
| 第五章 肌球蛋白基因克隆及表达分析 | 第122-136页 |
| 0 前言 | 第122页 |
| 1 材料和方法 | 第122-126页 |
| 1．1 材料 | 第122-123页 |
| 1．1．1 实验动物 | 第122页 |
| 1．1．2 引物 | 第122-123页 |
| 1．1．3 工具酶 | 第123页 |
| 1．1．4 试剂 | 第123页 |
| 1．2 方法 | 第123-126页 |
| 1．2．1 总RNA提取 | 第123页 |
| 1．2．2 合成cDNA第一链 | 第123页 |
| 1．2．3 PCR扩增肌球蛋白基因片断 | 第123-124页 |
| 1．2．4 克隆目的片断 | 第124页 |
| 1．2．5 3′RACE及5′RACE扩增 | 第124-125页 |
| 1．2．6 克隆RACE扩增片断 | 第125-126页 |
| 1．2．7 RT-PCR分析栉孔扇贝肌球蛋白Ⅵ组织表达 | 第126页 |
| 1．2．8 栉孔扇贝外套膜肌球蛋白Ⅵ在大肠杆菌中的表达 | 第126页 |
| 1．2．9 SDS-PAGE | 第126页 |
| 2 结果 | 第126-134页 |
| 2．1 栉孔扇贝外套膜肌球蛋白基因片断RT-PCR结果 | 第126-127页 |
| 2．2 序列测定及所编码氨基酸序列同源性比较 | 第127-128页 |
| 2．3 RACE扩增结果 | 第128-132页 |
| 2．4 RT-PCR分析 | 第132页 |
| 2．5 栉孔扇贝肌球蛋白Ⅵ基因部分序列在大肠杆菌中的表达 | 第132-134页 |
| 3． 讨论 | 第134-136页 |
| 参考文献 | 第136-156页 |
| 致谢 | 第156页 |
