| 第一章 前言 | 第1-20页 |
| ·实现高密度培养的策略 | 第13-15页 |
| ·λ噬菌体Red同源重组技术 | 第15-20页 |
| ·Red重组系统的组成 | 第15-16页 |
| ·Red重组的机制 | 第16页 |
| ·Red重组系统在微生物基因敲除中的应用 | 第16-19页 |
| ·展望 | 第19-20页 |
| 第二章 大肠杆菌vgb基因整合及ptrG基因敲除 | 第20-34页 |
| ·材料 | 第20-21页 |
| ·菌株与质粒 | 第20页 |
| ·培养基 | 第20页 |
| ·引物 | 第20-21页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第21页 |
| ·工具酶及试剂盒 | 第21页 |
| ·方法 | 第21-23页 |
| ·基因的扩增 | 第21页 |
| ·质粒的构建 | 第21-22页 |
| ·基因组的提取 | 第22页 |
| ·质粒的提取 | 第22页 |
| ·VHb的定性定量方法 | 第22-23页 |
| ·原理 | 第22页 |
| ·方法 | 第22-23页 |
| ·CO的制备 | 第23页 |
| ·结果和讨论 | 第23-34页 |
| ·vgb基因的PCR扩增 | 第23-24页 |
| ·质粒pMTV1的构建及检测 | 第24-26页 |
| ·Red重组片断的获得 | 第26-27页 |
| ·PCR扩增 | 第26-27页 |
| ·酶切分离 | 第27页 |
| ·Red重组 | 第27页 |
| ·变异菌株的鉴定 | 第27-28页 |
| ·变异菌株的进一步鉴定 | 第28-29页 |
| ·pMTV1H测序结果 | 第29-30页 |
| ·质粒pKD46的消除 | 第30-31页 |
| ·VHb活性的检测 | 第31-34页 |
| 第三章 变异株生长特性研究 | 第34-42页 |
| ·材料 | 第34页 |
| ·菌株 | 第34页 |
| ·培养基 | 第34页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第34页 |
| ·方法 | 第34-36页 |
| ·发酵液中葡萄糖残留量的测定 | 第34-35页 |
| ·原理 | 第34-35页 |
| ·DNS试剂的配制 | 第35页 |
| ·葡萄糖溶液标准曲线的测定 | 第35页 |
| ·发酵液中葡萄糖含量的测定 | 第35页 |
| ·发酵液pH值的测定 | 第35-36页 |
| ·结果和讨论 | 第36-42页 |
| ·葡萄糖溶液标准曲线的测定 | 第36页 |
| ·测定DH5α及其变异株在LBG培养基中的生长 | 第36-39页 |
| ·测定JM109及其变异株在LBG培养基中的生长 | 第39-42页 |
| 第四章 变异株外源基因表达 | 第42-49页 |
| ·材料 | 第42-43页 |
| ·菌种和质粒 | 第42页 |
| ·培养基 | 第42页 |
| ·试剂和仪器 | 第42-43页 |
| ·工具酶及试剂盒 | 第43页 |
| ·主要溶液 | 第43页 |
| ·方法 | 第43-44页 |
| ·质粒的构建 | 第43页 |
| ·质粒的提取 | 第43页 |
| ·薄层板的制作 | 第43页 |
| ·N-氨甲酰氨基酸水解酶活性的检测 | 第43-44页 |
| ·结果和讨论 | 第44-49页 |
| ·质粒pBV220E3的构建 | 第44-45页 |
| ·N-氨甲酰氨基酸水解酶活性的检测 | 第45-46页 |
| ·N-氨甲酰氨基酸水解酶在变异菌株中的表达 | 第46-47页 |
| ·薄层层析分析N-氨甲酰氨基酸水解酶的活性 | 第47-49页 |
| 第五章 分泌表达元件的分离和应用 | 第49-77页 |
| ·材料 | 第50-53页 |
| ·菌种和质粒 | 第50页 |
| ·培养基 | 第50页 |
| ·实验动物 | 第50页 |
| ·试剂 | 第50-51页 |
| ·主要仪器 | 第51页 |
| ·工具酶及试剂盒 | 第51页 |
| ·PCR引物 | 第51-52页 |
| ·主要溶液 | 第52-53页 |
| ·方法 | 第53-59页 |
| ·短芽孢杆菌DY50基因文库的构建 | 第53-55页 |
| ·短芽孢杆菌DY50基因组的提取 | 第53-54页 |
| ·DNA的定量 | 第54-55页 |
| ·短芽孢杆菌DY50胞壁蛋白的纯化 | 第55-56页 |
| ·硫酸铵沉淀 | 第55页 |
| ·透析膜的处理 | 第55页 |
| ·离子交换柱DEAE Sepharose Fast Flow柱及Q Sepharose High Performance柱 | 第55-56页 |
| ·疏水柱 | 第56页 |
| ·抗体的制备 | 第56-57页 |
| ·琼脂双扩散法检测抗体 | 第56页 |
| ·酶联免疫吸附实验测定效价 | 第56-57页 |
| ·Dot-ELISA筛选基因组文库 | 第57-58页 |
| ·枯草芽孢杆菌分泌表达元件的分离和应用 | 第58-59页 |
| ·基因的扩增 | 第58页 |
| ·质粒的构建 | 第58页 |
| ·质粒的提取 | 第58页 |
| ·薄层板的制作 | 第58页 |
| ·N-氨甲酰氨基酸水解酶活性的检测 | 第58-59页 |
| ·结果和讨论 | 第59-77页 |
| ·基因组文库的构建 | 第59-62页 |
| ·短芽孢杆菌DY50基因组的提取 | 第59页 |
| ·基因组DNA的定量 | 第59页 |
| ·短芽孢杆菌DY50基因组DNA的部分酶切 | 第59-60页 |
| ·酶切反应条件考察 | 第59-60页 |
| ·大量DNA的部分酶切 | 第60页 |
| ·基因组DNA部分酶切片段与载体臂的连接反应 | 第60-61页 |
| ·连接产物的包装 | 第61页 |
| ·包装产物的转染 | 第61页 |
| ·基因组的覆盖率 | 第61-62页 |
| ·噬菌体库的保存 | 第62页 |
| ·短芽孢杆菌DY50胞壁蛋白的纯化 | 第62-66页 |
| ·硫酸铵沉淀及透析 | 第62-63页 |
| ·DEAE Sepharose Fast Flow柱纯化 | 第63-64页 |
| ·Q Sepharose High Performance柱分离纯化胞壁蛋白 | 第64页 |
| ·Phenvl Sepharose High Performance疏水柱分离纯化胞壁蛋白 | 第64-65页 |
| ·纯化蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳 | 第65-66页 |
| ·短芽孢杆菌胞壁蛋白抗体的制备 | 第66-69页 |
| ·抗原佐剂乳化剂样品制备 | 第66页 |
| ·免疫注射 | 第66页 |
| ·试血 | 第66-67页 |
| ·琼脂双扩散法检测 | 第67-68页 |
| ·抗血清效价的测定 | 第68页 |
| ·大量取血 | 第68-69页 |
| ·Dot-ELISA筛选基因组文库 | 第69页 |
| ·枯草芽孢杆菌分泌表达元件的分离和应用 | 第69-77页 |
| ·PCR扩增α-淀粉酶基因 | 第69-70页 |
| ·质粒pMD18-Amy的构建 | 第70页 |
| ·检测α-淀粉酶活性 | 第70-71页 |
| ·PCR扩增α-淀粉酶基因启动子及信号肽 | 第71-72页 |
| ·质粒pBEZA的构建及检测 | 第72-73页 |
| ·PCR扩增N-氨甲酰氨基酸水解酶基因 | 第73-74页 |
| ·表达质粒pBE2AC的构建 | 第74-75页 |
| ·N-氨甲酰氨基酸水解酶活性的检测 | 第75-77页 |
| 第六章 结论及总讨论 | 第77-82页 |
| ·结论 | 第77页 |
| ·总讨论 | 第77-82页 |
| 参考文献 | 第82-86页 |
| 致谢 | 第86页 |
